＜GUT＞論文解釈：CPA1突然変異はどのように慢性膵炎をを引き起こすのか？
慢性膵炎は、さまざまな原因により膵臓の組織と機能に不可逆的な変化を引き起こす慢性炎症性疾患である。 その発症は通常、消化酵素またはそれらの阻害剤に関連する遺伝的要因によって決定される。 PRSS1、SPINK1、およびCTRCなどの遺伝子の変異は、トリプシンレベルと膵炎リスクを変化させる。
重要なことに、慢性膵炎の遺伝的リスクは、トリプシン活性とは無関係のメカニズムによっても媒介される可能性がある。例えば、いくつかのPRSS1変異はトリプシン活性に影響を及ぼさないが、酵素のミスフォールディングを引き起こし、ERストレスを引き起こす。同様に、ＣＰＡ１突然変異もまた体外で酵素ミスフォールディングを引き起こし、細胞滞在、分解及びするＥＲストレスをもたらす。
in vitroで観察された結果は突然変異によるミスフォールディングおよびERストレスを支持しているが、適切な動物モデルの証拠はなく、CPA1突然変異の病因も仮定されている。 これは疾患メカニズムの研究を制限し、また新しい治療法の前臨床試験を妨げる。
米国のボストン大学の研究者らは、マウスCpa1遺伝子座にヒトCPA1p.N256K変異を有する新規ノックインマウス系統を確立した。また、このマウス系統の研究を通して、彼らはCPA1変異が酵素ミスフォールディングを引き起こし、ERストレスのメカニズムを通して慢性膵炎を引き起こすことを確認しました。 この重要な結果は、消化管のトップジャーナル＜Gut＞に掲載されました。
この研究の意義は、これが消化酵素のミスフォールディングおよびERストレスに関わる慢性膵炎の最初のマウスモデルであるということである。 慢性膵炎の発症と進行に対するさまざまな環境要因（アルコール、喫煙、高脂肪食など）または薬物の影響をテストするのに特に適している。
この研究では、ボストン大学のMiklósSahin-TóthとEszter Hegyiが、遺伝子ターゲティングによるCPA1変異ノックインマウスCyagen に依頼した。 同時に、CPA1 null系統も作製した。ネオマイシン（neo）発現カセットの存在がCpa1 mRNAおよびCPA1タンパク質発現のレベルの低下をもたらしたので、 この系統は、CPA1タンパク質活性の喪失とCPA1のミスフォールディングとを区別するための対照として役立つ。
CPA1 N256KおよびCPA1 Null マウスの膵臓におけるCpa1 mRNAの発現を同定するために、研究者らは1ヶ月齢の動物から膵臓cDNAを調製した。定量的PCR分析は、CPA1 N256KのCPA1 mRNA発現がC57BL/6Nコントロールと比較して30%減少した一方、CPA1 Nullは95%減少したことを示した。 ウエスタンブロット分析はまた、CPA1 N256KのCPA1タンパク質含有量は減少したが依然として有意であることを示したが、CPA1 NullはCPA1タンパク質の発現を検出できなかった（図1）。
図１CPA1 N256Kマウス作製および突然変異体対立遺伝子の発現。（A）遺伝子ターゲティングによるCPA1 N256KおよびCPA1 Nullマウスの作製。（B）定量PCRよる1月齢CPA1 N256K、CPA1 nullおよびC57BL/6Nの膵臓におけるCpa1 mRNAの発現。（C）western blotよるCPA1 N256K、CPA1 nullおよびC57BL/6Nの膵臓におけるCpa1 mRNAの発現。
その後、彼らは、６週齢のCPA1 N256KおよびC57BL/6Nコントロールマウスから膵臓腺房細胞を単離し、培地へのCPA1の分泌を測定した。 CPA1 p.N256K変異体の分泌は、野生型CPA1タンパク質と比較してほとんど検出されなかった。 一方、腺房細胞溶解物のウエスタンブロット分析は、高レベルのCPA1変異タンパクを示して、これは、変異タンパク質が細胞内に保持されていることを示している（図２）。 同時に、彼らはまた、N256K株の細胞内CPA1タンパク質レベルがコントロールりわずかに低いことを観察でき、これはいくつかのミスフォールディングおよび保持された変異タンパク質が分解されたことを示している。
CPA1 N256K及びC57BL/6Nコントロールマウスの腺房細胞によって分泌されたCPA1 タンパク質（自発的またはセルレイン誘導）。 （Ａ）CPA1 は、30μＭセルレインを添加してまたは添加せずに60分間インキュベートした後に培地に分泌される。 （Ｂ）30μＭセルレインを添加してまたは添加せずに60分間インキュベートした後の細胞溶解物中のCPA1 含有量。
研究者らは、2つの新しいCPA1系統のいずれも有意な表現型の変化同時に正常な生殖が可能とのことを見出した。 CPA1 nullマウスおよびC57BL/6Nコントロールマウスの膵臓形態は類似していた。 一方、CPA1 N256Kマウスは3ヶ月齢以降小さい膵臓を有することが観察された。 重量分析は、CPA1 N256K系統の膵臓の萎縮を確認した。 膵臓萎縮の組織学的変化を確認するために、彼らは1、3、6および12ヶ月齢のマウスの膵臓切片を染色し、それらを対応するCPA1 null切片およびC57BL/6N切片と比較した。
CPA1 N256K変異マウスについて、研究者らは、腺房細胞萎縮および炎症細胞浸潤を含む慢性膵炎の徴候を観察した。 この結論は、CPA1 N256Kマウスの腺房における広範囲の線維症を明らかにしたマッソン三色染色によってさらに確認された。 彼らはまた、サイトケラチン19およびSox9の免疫組織化学的染色によって腺房 - カテーテル化生を観察した。一方、CPA1 nullでは、C57BL/6Nコントロールマウスと同様に、膵臓疾患の徴候を示さなかった（図３）。
CPA1 N256Kマウスの線維症および腺房カテーテル異形成。 （A）マッソントリクローム染色は、 CPA1 N256Kマウスの腺房の周囲に広範な線維症（青色）を明らかにした。 （B） CPA1 N256Kマウスの膵臓中のヒドロキシプロリン含有量は、 CPA1 nullマウスおよびC57BL/6Nコントロールと比較して増加した。 （C）CK19およびSox9の免疫組織化学的結果は、CPA1 N256Kマウスにおいて広範な腺房 - カテーテル異形成を示したが、CPA1 nullマウスにおいては示さなかった。
最後に、CPA1 N256K系統の組織学的変化がERストレスマーカーの上昇と関連しているかどうかを決定するために、研究者らは、マウスのシャペロンタンパク質Hspa5（BiP）と転写因子をそれぞれ1ヶ月、3ヶ月、12ヶ月で測定した。 Ddit3（CHOP） CPA1 N256KマウスにおけるBiPは、C57BL/6NおよびCPA1 nullコントロールと比較して一貫性があるが中程度の上方制御を示したが、CHOPはすべての時点で有意な上方制御を示した（図４）。
CPA1 N256Kマウス、CPA1 nullマウス、およびC57BL/6Nコントロールマウスにおける小胞体ストレスマーカーHspa5及びDdit3の発現、A、B、およびCは、それぞれ、1ヶ月、3ヶ月、および12ヶ月に対応する。 年齢 定量的PCRを膵臓cDNAサンプルで行い、結果をC57BL / 6Nの結果の平均に対する変化倍数として表した。
CPA1 N256Kノックインマウスに関する一連の実験は、CPA1突然変異p.N256Kが酵素をミスフォールドさせ、そしてERストレスに関連するプロアポトーシス転写因子CHOPのアップレギュレーションを伴う慢性膵炎を引き起こすことを示した。 これらの病理学的現象はCPA1 nullマウスでは観察されず、CPA1 機能の喪失それ自体が腺房細胞損傷を引き起こさないことを示している。 ミスフォールド依存性経路は、慢性膵炎においても病原性の役割を果たしており、これはまた、ERストレス関連メカニズムを標的とする治療的介入のための基礎を築く。
研究者らは、ミスフォールディングによって引き起こされる慢性膵炎のこの新しいモデルが前臨床試験において役割を果たすと予想されることを強調している。 CPA1 N256Kマウス系統は正常に発生しそして繁殖する。 これらの特性は、膵臓病変のスケジュールとともに、さまざまな環境損傷（アルコール、喫煙、高脂肪食）や慢性膵炎の治療薬をテストするための理想的なモデルになる。
原文
Human CPA1 mutation causes digestive enzyme misfolding and chronic pancreatitis in mice
Gut 2018;0:1–12. doi:10.1136/gutjnl-2018-315994
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