遺伝子工学マウス遺伝子型PCR同定の基本原則は遺伝子工学マウスと野生型マウスとのゲノム配列の違いを利用して、マウスゲノムDNAをテンプレートとしてPCRを行い、ゲル電気泳動比で異なる遺伝子型の特異産物のサイズを比較し、ストリップの大きさによってマウスの異なる遺伝子型を区別することである。前回はノックインマウスの同定を説明しました。今回は点突然変異マウス、トランスジェニックマウスとESターゲット技術で作製したマウスの同定を紹介します。

一、点突然変異マウスをどう同定するか？

点突然変異は単一塩基或いは少数の塩基の増加、欠失や置き換えだけで、電気泳動図で突然変異断片と野生型ストリップのサイズは区別できない。そのため、PCRだけで同定できなく、シークエンシング或いは酵素分解と結合して同定する必要である。

1．プライマーの設計

点突然変異が発生する上流・下流断片にプライマーを設計する。酵素分解サイトの両側の断片のサイズを区別するために、プライマーを設計する時、突然変異が発生した後で酵素分解サイトがあるか考慮する必要である。まずPCR拡大を行い、そして拡大産物を電気泳動を行った後でゴム切りまたはシークエンシングをする。もし突然変異のサイトの後はちょうどある酵素の特異識別サイトであれば、酵素分解実験で検証してもいい。酵素分解が成功すると、点突然変異が発生した断片を二つに切る。野生型は酵素により識別しないので、切られない。酵素分解サイトを導入しないなら、PCR産物のシークエンシングするしかない。ピーク図を通して目的塩基は突然変異が発生したか分析する。

2．予想される断片サイズと電気泳動の結果

F/Rを使用して拡大する。ストリップ1のサイズは野生及び陽性のストリップである。ゴムを切って回収して検測する。

二、トランスジェニックマウスをどう同定するか？

トランスジェニックマウスは技術の制限で、コピー数と挿入サイトが不確定で、陽性と判断するしかない。通常、3対以上のプライマーを設計し、同時に陽性と同定すれば、陽性マウスと判断する。繁殖過程で、異なるlineのF0とWTを別々継代するのを勧める。発現量の検証を通して一番いい継代lineを選別する。

三、ESターゲット技術で作製したマウスをどう同定するか？

ESターゲット技術で作製したマウスの同定方法と設計原理はCRISPR/Cas9と似ている。ES技術がNeo選別を使用した。サイヤジェン株式会社のTurboKnockout技術はこのエレメントを自己削除したF1マウスを得るので、Neoに対する検証は不要である。

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