1. C57BL/6J ACE2 ノックアウトマウス
● モデル作製:
モデル名:ACE2-KO
バックグラウンド系統C57BL/6J
● IHC-P バリデーション:
モデル確立後、マウスの異なる組織をホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、免疫組織化学実験により評価した。腸、肺、肝臓、脳、気管、腎臓、胃、心臓で陰性であったことから、ノックアウトマウスで測定可能なACE2の発現がないことが確認され、KOモデル作製に成功したことが示された。
● C57BL/6J 陰性対照:
C57BL/6Jマウスの組織をホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、免疫組織化学実験により評価した。その結果、腸、肺、肝臓、脳、気管、腎臓、胃、心臓で陰性であったことが報告された。
1. C57BL/6J ACE2ノックインマウス(H11遺伝子座)
● モデル作製:
モデル名:H11-ACE2-KI
バックグラウンド系統C57BL/6J
構築戦略:ヒトのシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインをマウスH11遺伝子座に挿入
マウスH11遺伝子座にヒトシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインを挿入。
● IHC-P バリデーション:
モデル確立後、マウスの異なる組織をホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、免疫組織化学実験により評価した。その結果、腸、肺、肝臓、脳、気管、腎臓、胃、心臓で異なるレベルのACE2発現を示したが、K18プロモータは依然として非特異的に発現しており、異なる実験の必要性に応じた選択が可能であることが判明された。
● C57BL/6J 空白対照:
C57BL/6J
空白対照マウスの組織をホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、免疫組織化学実験により評価した。その結果、腸、肺、肝臓、脳、気管、腎臓、胃、心臓で陰性であることが報告された。
* このモデルに関する資料はこちらをご覧ください。
1. C57BL/6J ヒト化ACE2(hACE2)マウス
● モデル作製:
モデル名:ACE2-KI
バックグラウンド系統C57BL/6J
構築戦略:マウスのシグナルペプチドと内在性PolyAを保持し、マウスAce2の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインをヒトACE2のものに置換。
● qPCRバリデーション:
モデル確立後、マウスの異なる組織を採取し、qPCRバリデーションを行った。その結果、小腸、大腸、腎臓、肺、気管でhACE2が発現しており、ヒトACE2遺伝子の転写産物の発現に成功し、遺伝子レベルでヒト化モデルの検証ができた。
● IHC-P バリデーション:
モデル確立後、マウスの異なる組織をホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、免疫組織化学実験を行った。その結果、腸、腎臓、肺、気管にhACE2タンパク質が発現しており、ヒト化モデルがヒトACE2タンパク質を正常に発現できることが確認され、モデル検証は成功した。
● C57BL/6J 空白対照:
C57BL/6J
空白対照マウスの組織をホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋後、免疫組織化学実験により評価した。その結果、腸、肺、肝臓、脳、気管、腎臓、胃、心臓で陰性であることが報告された。
● WBバリデーション: 臓器による発現の違い:
大腸、小腸、腎臓、脳、気管、肺の6組織を別々に検査。ヒトACE2の理論上のバンドサイズは92KDであり、
タンパク質のグリコシル化修飾により、タンパク質自体が大きすぎる可能性がある。

結論:
1. 脳と肺の組織では、すべての標的クローンは、野生型と有意差のあるバンドは検出されなかった。
2. 腎臓組織では、理論上のバンドサイズは92KDであるが、実際のバンドサイズは120KDである。
3. 大腸組織では、理論上のバンドサイズは92KDであるが、実際のバンドサイズは130KDである。
4. 気管組織では、理論上のバンドサイズは92KDであるが、実際のバンドサイズは120KDである。
5. 小腸組織では、理論上のバンドサイズは92KDであるが、実際のバンドサイズは130KDである。
ヒト化ACE2(hACE2)マウスにおけるACE2タンパク質の発現は、個体差や組織の違いによって大きく異なる。
2. BALB/c ヒト化ACE2 (hACE2)マウス
● モデル作製:
モデル名:ACE2-KI 系統バックグラウンド:BALB/c
構築戦略:マウスのシグナルペプチドと内在性PolyAを保持し、マウスAce2の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインをヒトACE2のものに置換。
● IHC-P バリデーション:
モデルを確立した後、マウスの異なる組織をホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、免疫組織化学実験により評価した。その結果、腸、肺、肝臓、脳、気管、腎臓、胃、心臓でhACE2が発現しており、ヒト化モデルがヒトACE2タンパク質を正常に発現できることが確認され、モデルの検証は成功した。

● BALB/c 陰性対照:
BALB/c
空白対照マウスの組織をホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、免疫組織化学実験により評価した。その結果、腸、肺、肝臓、脳、気管、腎臓、胃、心臓で陰性であることが報告された。