事例紹介：バリデーションデータ
CAR-T細胞療法では、CAR分子が治療効果の鍵を握っています。CARの分子構造には、腫瘍抗原を認識する抗体単鎖可変領域やヒンジ領域、細胞内共刺激ドメインやシグナル伝達ドメインなどがあります。その設計の合理性は、殺傷効果、in vivoでの持続性、安全性などに影響を及ぼします。したがって、異なる腫瘍治療標的に対して、合理的かつ効果的なCAR分子を設計し、CARレンチウイルスにパッケージして、その後CAR-T細胞を構築する必要があります。
CD19抗原レンチウイルスのパッケージングと力価検出
CD19抗原を発現するレンチウイルス精製液を連続希釈(0.01, 0.1, 1, 10 μl),し、それぞれ同数の293T細胞に添加しました。72時間後、フローサイトメトリーにより293T細胞の陽性率を検出し、以下のウイルスのトランスダクション力価の計算式に従って算出しました。
Figure 1. Detection results of CD19 antigen lentivirus titer.
図1に示されるように、感染したウイルスの勾配が増加するにつれ、CD19抗原陽性細胞の数が徐々に増加しました。これはレンチウイルスが優れた感染活性を有していることを示しており、上記の式に従ってウイルスの力価を算出したところ、1.4×108 Tu/mlであることがわかりました。
CD19-293T安定トランスフェクション細胞株の構築
上記、調製に成功したCD19ウイルスを293T細胞にトランスフェクトし、複数回のスクリーニングの結果、ほぼ100％の陽性率でCD19-293T細胞を取得することができました。陽性率試験結果を下図に示します。
Figure 2. Detection results of the positive rate of CD19-293T stably transformed cell lines.
CD19-CARレンチウイルスのパッケージングと力価測定
CD19標的に対する第2世代のクラシックなCAR分子をレンチウイルスベクターに設計し、CD19-CARレンチウイルスをパッケージしました。ウイルス力価は上記の方法で検出され、計算された力価は4.33×108 Tu/mlです。
Figure 3. Molecular structure of CD19 CAR, in which the VH and VL sequences are derived from the CD19 antibody FMC63 clone.
Figure 4. Detection results of CD19 CAR lentivirus titer.
その他のレンチウイルス感染：異なる細胞への影響
Figure 5. Effects on other cells infected with lentivirus.
