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  4. CAR-T細胞療法の研究を加速する

体内の免疫機能を利用して腫瘍細胞を死滅させる免疫細胞療法は、多くのがんを治療する画期的な方法として期待されています。中でも、キメラ抗原受容体T細胞免疫療法(CAR-T)は、様々な血液悪性腫瘍の治療において目覚ましい成果を上げています。2022年現在、世界で7つのCAR-T細胞療法製品が承認されており、そのうち3つは中国での承認を受けています。

CAR-T細胞治療薬の長い道のりは、再現性を重視した基礎研究の着実な実行から始まります。研究プロセスには一般的に、CAR分子の設計、レンチウイルスのパッケージング、CAR-T細胞の構築、in vitroおよびin vivoの殺傷アッセイ、細胞毒性試験などが含まれます。効果的で安定したCAR-T細胞を構築するためには、CAR分子構造の合理的な設計、T細胞導入条件の検討、CAR-T細胞の同定、純度や効力の確認など、多くの要素を十分に考慮する必要があります。

サイヤジェンは、腫瘍免疫研究における16年以上の細胞・動物モデルの開発経験を基に、in vivoおよびin vitroのCAR-T細胞療法研究のためのワンストップサービス・プラットフォームを提供しています。世界中の研究者が利用できる当社のプラットフォームには、scFv配列スクリーニング、CAR分子設計、およびCAR-T細胞療法の基礎研究を開発するためのフルプロセスサービスが含まれています。これらの包括的なサービスにより、CAR-T/NK研究および関連分野の効率性を改善できます。プロジェクトの無料相談は、お問い合わせまたは[email protected]までメールでお問い合わせください。

CAR-T細胞療法研究のための
ワンストップ サービスプラットフォーム
ウイルスベクターの製造
  • CARの設計
  • CARの設計
  • CAR-T細胞の構築
腫瘍モデル構築のための
プラットフォーム
  • 標的細胞の構築
  • C-NKG重度免疫不全マウスモデル
  • CDXマウス腫瘍モデル
  • PBMC/HSC免疫系ヒト化モデル
in vitroでの薬物動力学評価
  • CAR-T細胞のin vitro殺傷機能評価
  • サイトカインの検出
  • 細胞の増殖/アポトーシス/遊走/浸潤などの機能試験
in vivoでの薬物動力学評価
  • CDX C-NKG マウスおよびCDX PBMC/HSC C-NKG マウスの構築
  • CAR-T/TCR-T/NK/TIL細胞の薬物動力学評価
  • 免疫組織化学染色(IHC)、HE染色、リンパ球浸潤解析
プロジェクトタイプ プロジェクトにおける技術的な課題 サイヤジェンのプラットフォームサービスのメリット
標的細胞の構築 標的細胞の種類の選択が難しい 腫瘍細胞や過剰発現CHO/HEK293細胞の幅広い在庫を用意
標的の発現量が十分でない 500以上の安定形質転換細胞株構築プロジェクトにおいて豊富な経験を有する
CARベクターの設計とレンチウイルスのパッケージング CAR分子構造の設計に対する経験不足 異なる標的のCAR分子設計において豊富な経験を有する
ウイルスの力価が低く、精製が困難である 高品質なレンチウイルスベクターとウイルスのパッケージングを、複数の査読付き論文で発表済み
CAR-T/NK細胞の構築 T/NK細胞の培養が難しい 16年以上の初代細胞培養の経験を有する
T/NK細胞のトランスフェクション条件の評価に時間がかかるため、トランスフェクション後の細胞の同定が難しい 人/マウスの免疫細胞のトランスフェクションパラメータを完全にまとめるための最適化されたプロトコルを提供可能
in vitroおよびin vivo
殺傷アッセイ
評価指標の選択が難しい 成熟したin vitroおよびin vivoの薬力学的実験プラットフォームを有する
データ解析 論文発表およびIND申請に成功した、in vitroおよびin vivo両方の試験において広範な経験を有する
案例展示 事例紹介:バリデーションデータ
1
CARの分子設計とレンチウイルスのパッケージング
2
CAR-T細胞の調製
3
In vitroでの薬効評価

CAR-T細胞療法では、CAR分子が治療効果の鍵を握っています。CARの分子構造には、腫瘍抗原を認識する抗体単鎖可変領域やヒンジ領域、細胞内共刺激ドメインやシグナル伝達ドメインなどがあります。その設計の合理性は、殺傷効果、in vivoでの持続性、安全性などに影響を及ぼします。したがって、異なる腫瘍治療標的に対して、合理的かつ効果的なCAR分子を設計し、CARレンチウイルスにパッケージして、その後CAR-T細胞を構築する必要があります。

CD19抗原レンチウイルスのパッケージングと力価検出

CD19抗原を発現するレンチウイルス精製液を連続希釈(0.01, 0.1, 1, 10 μl),し、それぞれ同数の293T細胞に添加しました。72時間後、フローサイトメトリーにより293T細胞の陽性率を検出し、以下のウイルスのトランスダクション力価の計算式に従って算出しました。

Figure 1. Detection results of CD19 antigen lentivirus titer.

図1に示されるように、感染したウイルスの勾配が増加するにつれ、CD19抗原陽性細胞の数が徐々に増加しました。これはレンチウイルスが優れた感染活性を有していることを示しており、上記の式に従ってウイルスの力価を算出したところ、1.4×108 Tu/mlであることがわかりました。

CD19-293T安定トランスフェクション細胞株の構築

上記、調製に成功したCD19ウイルスを293T細胞にトランスフェクトし、複数回のスクリーニングの結果、ほぼ100%の陽性率でCD19-293T細胞を取得することができました。陽性率試験結果を下図に示します。

Figure 2. Detection results of the positive rate of CD19-293T stably transformed cell lines.
CD19-CARレンチウイルスのパッケージングと力価測定

CD19標的に対する第2世代のクラシックなCAR分子をレンチウイルスベクターに設計し、CD19-CARレンチウイルスをパッケージしました。ウイルス力価は上記の方法で検出され、計算された力価は4.33×108 Tu/mlです。

Figure 3. Molecular structure of CD19 CAR, in which the VH and VL sequences are derived from the CD19 antibody FMC63 clone.
Figure 4. Detection results of CD19 CAR lentivirus titer.
その他のレンチウイルス感染:異なる細胞への影響
Figure 5. Effects on other cells infected with lentivirus.

CARウイルスのパッケージングが完了したら、次はT細胞にトランスフェクションを行い、CAR-T細胞を取得します。当社は2種類の高効率T細胞調製法を確立しており、いずれも高純度のT細胞(CD3+細胞の割合は98%以上に達する)を製造できますが、両者で増幅される異なるサブタイプのT細胞の割合は大きく異なります。

方法1で増幅されたT細胞は主にCD8+ T細胞のサブタイプで、方法2はCD8+ T細胞とCD4+ T細胞の割合に差が少ないT細胞集団を増幅できます。どちらの方法も、異なるサブタイプのT細胞の役割を研究するための堅固な基盤を提供します。

Figure 6. Experimental results of T cell phenotype analysis

レンチウイルス(LV)は、CAR-T細胞を構築するための重要な遺伝子導入ツールとなっています。CAR-T細胞の陽性率には、T細胞の活性化や増殖方法の違い、トランスフェクションの時間など、多くの要因が影響すると考えられます。当社は、様々な実験条件を最適化することで、レンチウイルストランスフェクションに基づく効率的なCAR-T細胞作製プロセスの確立に成功しました。

下図は、CD19 CAR-T細胞の陽性率の検出結果を示しています。この構造では、CD19抗体FCM63クローン由来のscFvが用いられているため、抗FMC63 scFv抗体によりトランスフェクション効率を検出することができます。その結果、CD19 CAR-T細胞の陽性率は45.59%に達することができ、高い陽性率を有するCD19 CAR-T細胞の構築に成功したことが示されました。

Figure 7. Detection results of positive rate of CD19 CAR-T cells.

CAR-T細胞が構築されると、関連する薬効評価を実施することができます。通常、CAR-T細胞の標的細胞に対する殺傷効果を観察するために、異なる効果対標的比が使用されます。CD19 CAR-T細胞およびT細胞とNalm6細胞とを異なる効果-標的比で48時間インキュベートし、フローサイトメトリーにより腫瘍細胞のアポトーシスが検出されました。

図に示すように、CD19 CAR-T細胞はT細胞群と比較して、効果-標的比の異なる条件下でNalm6細胞に対する特異的細胞傷害作用が有意に増強されました。

Figure 8. Experimental results of FMC63 CAR-T cells killing Nalm6 tumor cells.
A. The detection results of the positive rate of CD19 antigen on the surface of Nalm6 cells;
B. The results of CD19 CAR-T cells killing Nalm6 cells;
C. Detection results of IFN-γ content in the culture supernatant of Nalm6 cells killed by CD19 CAR-T cells.
マウスモデルカタログ