In vivo研究の利器として、ノックアウトマウスは科学研究者にとってはもちろん未知の領域ではない。しかし、コンベンショナルノックアウトマウスには、特定の遺伝子が特定の組織（および特定の時間）での機能を特異的に研究することができないという無視できない欠陥がある。それ以外に、コンベンショナルノックアウトマウスはある遺伝子の胚胎発育を影響するため、正常に出産することができなったり、出生後の重症な生理的欠陥で早期に死亡したり、後代を生むことができなくてホモ動物モデルを取得することができない場合がある。そのため、コンディショナルノックアウトマウス（conditional gene knock out or knock in）はこの情勢に呼応して誕生した。

論文でよく見られるCreマウスは、広く使用されているコンディショナルノックアウト方法ーCre/loxPシステムである。その原理と応用を紹介しましょう。

1. Cre組換え酵素とloxP部位

Cre組換え酵素（Cyclization Recombination Enzyme）は、大腸菌ファージP1のCre遺伝子によってコードされ、アミノ酸343個からなる38 kDのタンパク質である。触媒活性だけでなく、制限酵素と同様に、loxP部位を特異的に識別することができる。したがって、Loxpセグメントの間の遺伝子を組換または削除することができる。

LoxP（locus of X−overP1）は元来バクテリオファージP1ののゲノム中にある34塩基からなる配列であり、 中央8 bpは非対称な配列でその両側13 bpが対称になっている。その中で、逆位反復配列はCre組換え酵素の特異識別部位であり、間隔領域はloxP部位の方向を決定する。

2. Cre/loxPシステムの遺伝子組み換え原理

Cre/loxPシステムはCre組換え酵素とloxP部位の相互作用に基づいて、組換を誘発する方法はいくつかある。遺伝子がloxP部位があり、且つCre組換え酵素が存在する場合、Cre組換え酵素はloxP部位の両端の逆位反復配列と結合して二量体を形成する。この二量体は他のloxP部位の二量体と結合して四量体を形成する。次に、loxP部位の間のDNA配列はCre組換え酵素によって切り落とされ、切り口はDNA連結酵素によって再接続される。DNA組換の結果は主にloxP部位の方向と位置で決める。

• 二つのloxP部位は同じDNA鎖にあり、同方向に位置している場合、Cre（Deletion）によりloxP配列間の遺伝子はノックアウトする。
• 二つのloxP部位は同じDNA鎖にあり、異なる方向に位置している場合、CreによりloxP間の遺伝子は反転する（Inversion）。
• 二つのloxP部位は異なるDNA鎖または染色体にある場合、Creにより二つのDNA鎖の交換（Cassette change）または染色体の易位（Translocation）を誘発する。

3. Cre/loxPシステムを利用して特定遺伝子のノックアウトマウスを作製する

Cre/loxPシステムを利用して特定遺伝子を特定条件でノックアウトするのにトランスジェニックマウスが2匹必要である。胚胎幹細胞技術によりトランスジェニックマウスを1匹取得する。まず体外で両端に別々loxP部位が一つ含む目的遺伝子の配列を作製する。そしてこの配列を胚胎幹細胞に入れ、相当組換を通して元の配列を置き換える。処理された胚胎幹細胞を偽妊娠マウスの子宮に植え付け、完全な胚胎に発育させ、最後にトランスジェニックマウスになる。このトランスジェニックマウスでは、loxP部位が対応する遺伝子のイントロンに導入されており、理論的には対応する遺伝子の機能に影響しないため、一般的にこのマウスの表現型は正常である。もう一つのトランスジェニックマウスは通常、卵母細胞注射または胚胎幹細胞技術により得る。このマウスで、Cre組換え酵素はある特定遺伝子のプロモーターの調節の下に置かれ、特定条件で発現することができる。最後に、この2匹のマウスを交配させて、上述の2種類の遺伝子型を同時に含む子世代マウスはある特定種類の細胞である特定遺伝子を欠失する。

4. Cre/loxPシステムの利点と問題

現在、Cre/loxPシステムは最も広く使用されているコンディショナルノックアウトツールであり、主に次のような利点がある。

• 効率が高い：Cre組換え酵素とloxP部位を持つDNAフラグメントが二量体を形成した後、十分な能力を提供してその後のDNA組換を誘発し、組換は簡単で効率的になる。
• 特異性が強い：loxP配列の唯一性は遺伝子組換えの特異性を保証する。
• 応用範囲が広い：Cre組換え酵素は生物の異なる組織、異なる生理条件で作用することができる。
• II型プロモーターによって発現を起動することができる：Cre組換え酵素をコードする遺伝子は任意のII型プロモーターによって起動することができる。これにより、Cre組換え酵素は生物体の異なる細胞、組織、器官、または異なる発育段階または異なる生理条件での発現を保証し、高い組織および細胞特異性を実現する。

Cre/loxPシステムは独自の利点を持っているが、現在は主に標識遺伝子の削除または外来遺伝子の定点統合に限られている。このシステムは統合と削除においても欠陥がある。標記遺伝子は選択的に削除されたが、Cre酵素の切り口に34塩基のloxP部位が残した。これにより、冗長な外来DNA配列が依然として含まれる。さらに、このシステムは2つの部位を融合する反応機構は理論的根拠は乏しい。

要するに、Cre/loxP部位の特異性組換システムは正確に設計された遺伝的修飾を可能にしており、正確に外来遺伝子を導入するだけでなく、遺伝的スイッチを設定して、時空において外来遺伝子の発現と欠失を制御し、大きな応用の見通しを示している。現在、研究と応用はまだ不足であるすが、技術の発展につれて、このシステムはますます完璧になり、応用も広くなると信じております。

参考文献：

上海十院IBDチーム。

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