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CRISPR/Cas ROSA26 ノックインラット
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ラットモデルにおいて、一貫性があり、特定領域/組織特異的遺伝子発現を獲得するにはROSA26遺伝子座をターゲットにした挿入が理想的な選択です。 ROSA26座は、しばしば「safe harbor(安全な港)」と呼ばれ、副作用がなく遺伝子の発現も安定しているため、導入遺伝子挿入部位として広く使用されています。 現在、CRISPR / Casを用いたノックイン技術を適用することで、大きなDNAフラグメントをROSA26座に正確かつ迅速に導入することができます。 最低3匹以上ファウンダーマウスの納品を保証いたします。大きなフラグメントの場合、個別のケースごとに評価致します。
◆ CRISPR/Casが介する大きなフラグメントのノックインマウス(ROSA26)サービスの流れ
◆ サービスの詳細
ROSA26へのノックインストラテジーデザイン
ノックインしたい遺伝子名を教えてください。ヌクレアーゼ媒介ストラテジーを設計します。これには、ドナーベクターおよびgRNAベクターの設計、ならびにターゲット上のヌクレアーゼ活性を最大化し、ターゲット外活性を最小限にするアルゴリズムに基づくターゲット部位の選択が含まれます。PCRおよびシークエンスに基づくジェノタイピングアッセイもまた、ファウンダーラットのスクリーニングのために設計します。
ノックインベクター構築
ご希望のヌクレアーゼおよびドナーベクターを発言するDNAベクターを構築します。必要に応じて、これらのベクターの有効性を細胞培養において検査します。
CRISPR/Casの受精卵へのインジェクション
- mRNAの調整：ヌクレアーゼ発現ベクターをin vitroで転写します。獲得したmRNAは人工的にポリアデニル化され、哺乳動物細胞に置けるタンパク質へ適切に翻訳されます。
- ファウンダー獲得のためのヌクレアーゼインジェクション：ヌクレアーゼmRNAとドナーベクターを受精したラット卵へ同時にインジェクションし、代理母に移植して子孫を獲得します。ヌクレアーゼ発現ベクターを当社で設計および構築する場合、保証を満たすのに十分な数のインジェクションを行います。ヌクレアーゼ発現ベクター（またはmRNA産物）をお客様からご提供いただく場合、ご希望の突然変異をもつファウンダー獲得のために少なくとも200~300個の受精卵（株に基づく）にインジェクションし、スクリーニングを行います。 ファウンダーが特定されていない場合は、追加料金でより多くのインジェクションを行うことができます。
ファウンダースクリーニング
PCRおよびシークエンシングで、ファウンダーラットのスクリーニングをします。具体的には、ターゲット部位をPCR増幅して挿入を明らかにします。2本鎖が同時に編集される場合もございます。コンディショナルノックアウトでは、重大なエキソンに隣接する対立遺伝子に2つのloxPを持つ場合floxedラットと同定されます。
F1獲得のためのファウンダー繁殖
いくつかのプロジェクトでは、ファウンダーラットが成果物になります。しかし、F1ラットを獲得するためにファウンダーをさらに繁殖をご希望される方もいらっしゃいます。そこで、一致する系統の野生型ラットに3匹のファウンダーを繁殖させ、ノックイン対立遺伝子を有するF1ラットを獲得することができます。
