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ノックアウトラット

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ヌクレアーゼの発見(特にCRISPR/Cas9)が遺伝子改変動物の作製に利用されるまで、ラットの遺伝子機能をノックアウトすることは困難でした。ラットゲノム及びcas9の特定の部位を標的にするよう設計されたgRNAが受精卵にインジェクションされると、標的部位で切断され、挿入または欠失が生じます。切断部位が遺伝子のコード領域にある場合、下流にフレームシフト突然変異をもたらし、構成的ノックアウトを作製します。 重要なドメインをコードするエキソンの欠失させる場合、エキソンの上流および下流の部位を標的とする2つのgRNAをCas9と同時注入することで、希望する領域を欠失させたノックアウトラットを作製することができます。
◆ CRISPR/Cas9を用いたノックアウトラットサービスの流れ

 

ノックアウトラットサービスの流れ

 

◆ サービスの詳細

 

ノックアウトストラテジーデザイン

 

ノックアウトを希望する遺伝子名を教えてください。研究ニーズを満たすヌクレアーゼ媒介ストラテジーを設計します。 標的上のヌクレアーゼ活性を最大にし、標的外の影響を最小化する最適なアルゴリズムとヌクレアーゼ発現ベクターを設計します。成功率を高めるため、各遺伝子につき少なくとも2つの標的部位に対するベクターを設計します。 ファウンダースクリーニングのため、PCRおよびシークエンシングに基づくジェノタイピングも行います。

 

ヌクレアーゼ発現ベクター構築

 

ご希望のヌクレアーゼを発現するDNAベクターを構築します。 必要に応じて、これらのベクターの有効性を細胞培養においてテストします。

 

受精卵へのヌクレアーゼインジェクション 

 

- ヌクレアーゼmRNAの調整:ヌクレアーゼ発現ベクターをin vitroで転写します。獲得したmRNAは人工的にポリアデニル化され、哺乳動物細胞に置けるタンパク質へ適切に翻訳されます。

 

- ファウンダー獲得のためのヌクレアーゼインジェクション:ヌクレアーゼmRNAを受精したラット卵にインジェクションし、代理母に移植して子孫を獲得します。 ヌクレアーゼ発現ベクターを当社で設計および構築する場合、保証を満たすのに十分な数のインジェクションを行います。 ヌクレアーゼ発現ベクター(またはmRNA産物)をお客様からご提供いただく場合、ご希望の突然変異をもつファウンダー獲得のために少なくとも200~300個の受精卵(株に基づく)にインジェクションし、スクリーニングを行います。 ファウンダーが特定されていない場合は、追加料金でより多くのインジェクションを行うことができます。

 

ファウンダースクリーニング 

 

PCRおよびシークエンシングで、ファウンダーラットのスクリーニングをします。 具体的には、ヌクレアーゼによって標的化される部位のPCRを増幅し、続いて突然変異を明らかにするためにPCRの配列決定を行います。 少なくとも1本鎖においてフレームシフト欠失/挿入または重要なエキソン欠失を有するラットは、ノックアウトファウンダーと考えられます。また、標的部位の2本鎖ともノックアウトされる場合もございます。

 

F1獲得のためファウンダー繁殖 

 

いくつかのプロジェクトでは、ファウンダーのノックアウトラットが成果物になります。 しかし、F1ラットを獲得するためにファウンダーをさらに繁殖をご希望される方もいらっしゃいます。 そこで、一致する系統の野生型ラットに3匹のファウンダーを繁殖させ、ノックアウト対立遺伝子を有するF1ラットを獲得することができます。

ビジネス・開発・コラボレーションの機会については、お問い合わせください

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