サイヤジェンの特徴

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CRISPR/Cas9 ROSA26 ノックインマウス

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CRISPR/Cas9 ROSA26 ノックインマウス
マウスモデルにおいて、特定領域/組織特異的遺伝子発現を獲得するためにはROSA26が最も適切な挿入部位です。ROSA26は“safe harbor(安全な港)”と呼ばれることもあるほど、安定した発現に適した導入遺伝子の挿入部位として利用されています。現在、CRISPR/Cas9を用いたノックイン技術では、大きなDNAフラグメントの導入が可能です。ROSA26へ素早く効率的に導入可能で、その作製期間は最短で3ヶ月からとなります。当社では、最大6kbのフラグメントをROSA26にノックインした3匹以上ファウンダーマウスの納品を保証致します。
◆ ノックインマウス(全ての遺伝子座)、コンディショナルノックインマウス作製の流れ

◆ サービスの詳細

大きなフラグメントのノックイン/コンディショナルノックインのストラテジーデザイン
ノックインしたい遺伝子名をご教示頂いて、当社でヌクレアーゼを用いたストラテジーをデザイン致します。これには、ドナーベクター及びgRNAベクターのデザイン、そして標的部位のヌクレアーゼ活性を最大化し、オフターゲット効果を最小限にする最適化されたアルゴリズムに基づいた標的部位の選択が含まれています。ファウンダーマウスのスクリーニングのため、PCRとシークエンシングに基づくジェノタイピング分析のデザインも行います。

ノックインベクター構築
ご希望のヌクレアーゼを発現するDNAベクターを構築します。必要に応じて、これらのベクターの有効性を細胞培養でテストします。

CRISPR/Cas9 をマウス卵へインジェクション
- mRNAの準備: ヌクレアーゼ発現ベクターはin vitroで転写します。mRNA産物は人工的ポリアデニル化とキャップされ哺乳類細胞における適切な翻訳を容易にします。
- ファウンダー獲得のためのヌクレアーゼインジェクション: ヌクレアーゼmRNAとドナーベクターを受精卵へ同時にインジェクションした後、代理母へ受精卵を移植し子孫を獲得します。ヌクレアーゼ発現ベクターを当社でデザイン・構築した場合、保証を満たすのに十分な数の受精卵もしくは標的にインジェクションします。ヌクレアーゼ発現ベクター(もしくはmRNA)をお客様にご提供いただく場合、少なくとも200〜300個の受精卵(株に基づく)へインジェクションし、ご希望の突然変異を持つファウンダーのスクリーニングを行います。ファウンダーが特定されない場合、追加料金をお支払いいただくことで、更に多くのインジェクションが可能です。

ファウンダースクリーニング 
マウスがノックインされたファウンダーマウスであることを同定するためにPCRによるスクリーニングを行います。具体的には、ヌクレアーゼによって標的化される部位のPCRを拡大し、次に突然変異が起きているかどうかを明らかにするためPCR配列の判定を行います。

F1マウス獲得のための繁殖 
プロジェクトによっては、ファウンダーマウスが最終成果物となります。しかし、F1マウスの獲得がご希望の方も多くいらっしゃいます。当社では、野生型マウスと掛け合わせることのできる3匹のファウンダーマウスを繁殖します。そして、それらの子孫のジェノタイプを行い、ノックインされたF1マウスを獲得します。

ビジネス・開発・コラボレーションの機会については、お問い合わせください

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