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ご希望の遺伝子名とノックインしたい点突然変異を教えてください。ヌクレアーゼ媒介ストラテジーを設計します。これには、ターゲット上のヌクレアーゼ活性を最大にし、ターゲット外の影響を最小限にするアルゴリズムに基づくターゲット部位の選択が含まれます。PCRおよびシークエンスに基づくジェノタイピングアッセイも、ファウンダーラットのスクリーニングのために設計します。
ご希望のヌクレアーゼおよびドナーベクターを発言するDNAベクターを構築します。必要に応じて、これらのベクターの有効性を細胞培養において検査します。
- mRNAの調整：ヌクレアーゼ発現ベクターをin vitroで転写します。獲得したmRNAは人工的にポリアデニル化され、哺乳動物細胞に置けるタンパク質へ適切に翻訳されます。
- ファウンダー獲得のためのヌクレアーゼインジェクション：ヌクレアーゼmRNAとドナーベクターを受精したラット卵へ同時にインジェクションし、代理母に移植して子孫を獲得します。ヌクレアーゼ発現ベクターを当社で設計および構築する場合、保証を満たすのに十分な数のインジェクションを行います。ヌクレアーゼ発現ベクター（またはmRNA産物）をお客様からご提供いただく場合、ご希望の突然変異をもつファウンダー獲得のために少なくとも200~300個の受精卵（株に基づく）にインジェクションし、スクリーニングを行います。 ファウンダーが特定されていない場合は、追加料金でより多くのインジェクションを行うことができます。
PCRでファウンダーラットのスクリーニングをします。具体的には、ターゲット部位をPCR増幅して挿入を明らかにします。突然変異を確認するために、PCRの配列決定を行います。
いくつかのプロジェクトでは、ファウンダーラットが成果物になります。しかし、F1ラットを獲得するためにファウンダーをさらに繁殖をご希望される方もいらっしゃいます。そこで、一致する系統の野生型ラットに3匹のファウンダーを繁殖させ、ノックイン対立遺伝子を有するF1ラットを獲得することができます。