サイヤジェンの特徴

  • 作製期間の早さ
  • 高品質
  • グローバルサプライヤー
  • リーズナブルな価格設定

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CRISPR/Cas9 ノックアウトマウス

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CRISPR/Cas9 ノックアウトマウス
ヌクレアーゼを用いたゲノム編集技術(特にCRISPR/Cas9)は、従来のES細胞を用いた相同組み換えに基づくノックアウト動物作製に取って代わる新技術です。マウスゲノムの特定部位を標的とするようデザインされたgRNAとCas9を同時に受精卵へインジェクションすると、標的部位で切断が起き、修復が不完全となると挿入または欠失が生じます。切断部位が、遺伝子のコード領域にある場合、下流でフレームシフト突然変異が発生し、ノックアウトとなります。重要なドメインをコードとするエキソンを欠失させる場合は、エキソンの上流と下流の部位を標的とする2つのgRNAとCas9を同時にインジェクションします。そして、重要な領域を欠失させたノックアウトマウス系統を作製することができます。従来の技術であるES細胞の相同組み換えで作製した場合の8~12ヶ月と比べて、CRISPR/Cas9を利用したゲノム編集は、最短3ヶ月という短期間で作製することが可能です。弊社は、3匹以上ファウンダーマウスの納品を保証致します。
◆ CRISPR/Cas9を用いたノックアウトマウス作製の流れ

◆ サービスの内容

ノックアウトストラテジーデザイン
ノックアウトしたい遺伝子名をご提供頂き、当社でヌクレアーゼを用いたストラテジーを作成致します。これには、標的上のヌクレアーゼ活性を最大化し、オフターゲット効果を最小限にする最適化されたアルゴリズムに基づく、標的部位の選択も含まれています。また、ヌクレアーゼ発現ベクターをデザインします。ノックアウトする遺伝子については全て、確実に成功させるために少なくとも2つの標的部位に対するベクターをデザインいたします。そして、ファウンダーマウスのスクリーニングのため、PCRとシークエンシングに基づくジェノタイピング分析のデザインも行います。

ヌクレアーゼ発現ベクター構築
ご希望のヌクレアーゼを発現するDNAベクターを構築します。必要に応じて、これらのベクターの有効性を細胞培養でテストします。

マウス卵へのヌクレアーゼインジェクション 
- mRNAの準備: ヌクレアーゼ発現ベクターはin vitroで転写します。mRNA産物は人工的ポリアデニル化とキャップされ哺乳類細胞における適切な翻訳を容易にします。
- ファウンダー獲得のためのヌクレアーゼインジェクション: in vitroで転写されたヌクアレーゼmRNAは、受精卵にインジェクションされます。その受精卵は代理母に移植され、子孫を獲得します。ヌクレアーゼ発現ベクターを当社でデザイン・構築した場合、保証を満たすのに十分な数の受精卵もしくは標的にインジェクションします。ヌクレアーゼ発現ベクター(もしくはmRNA)をお客様にご提供いただく場合、少なくとも200〜300個の受精卵(株に基づく)へインジェクションし、ご希望の突然変異を持つファウンダーのスクリーニングを行います。ファウンダーが特定されない場合、追加料金をお支払いいただくことで、更に多くのインジェクションが可能です。

ファウンダースクリーニング 
ノックアウトマウスのファウンダーであることを同定するためにPCRによるスクリーニングを行います。具体的には、ヌクレアーゼによって標的化される部位のPCRを拡大し、突然変異が起きているかどうかを明らかにするためPCR配列の判定を行います。少なくとも1本鎖遺伝子に対してフレームシフト欠失・挿入または重要なエキソンの欠失が起きたマウスは、ノックアウトファウンダーとみなされます。時々、二本鎖とも編集されたマウスを獲得する場合もございます。

F1マウス獲得のための繁殖 
プロジェクトによっては、ファウンダーマウスが最終成果物となります。しかし、F1マウスの獲得がご希望の方も多くいらっしゃいます。当社では、野生型マウスと掛け合わせることのできる3匹のファウンダーマウスを繁殖します。そして、それらの子孫のジェノタイプを行い、ノックアウトされたF1マウスを獲得します。

◆ ドナー株情報

通常、CRISPRを用いたノックアウトマウスの作製にはC57BL/6およびFVBマウス使用していますが、お客様のご希望に合わせて他の系統を使用することも可能です。

ビジネス・開発・コラボレーションの機会については、お問い合わせください

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