遺伝子工学マウス遺伝子型PCR同定の基本原則は遺伝子工学マウスと野生型マウスとのゲノム配列の違いを利用して、マウスゲノムDNAをテンプレートとしてPCRを行い、ゲル電気泳動比で異なる遺伝子型の特異産物のサイズを比較し、ストリップの大きさによってマウスの異なる遺伝子型を区別することである。前回はコンディショナルノックインマウスの同定を説明しました。今回はノックインマウスの同定を紹介します。

F1世代陽性マウスのターゲットが正しいか検証する

プライマーの設計

外来DNAのシーケンスを正確に挿入するか、両側の相同腕のターゲットが正しいか検証するために、F1/R1を使用して5'arm末端を検証し、F2/R2を使用して3'arm末端を検証する。挿入区域に位置するプライマーをもう一対設計してもいい。陽性と同定されたマウスが引き続きSouthern Blot検証を行う。

予想される断片サイズ

ストリップ1のサイズ：F1/R1の拡大した5'arm末端であり、野生型の骨組み区域＋相同腕＋ノックイン区域が含まれる。

ストリップ2のサイズ：F2/R2の拡大した3'arm末端であり、野生型の骨組み区域＋相同腕＋ノックイン区域が含まれる。

コメント：ストリップ1とストリップ2は相同腕骨組み区域の検証で、サイズは通常2kb以上で拡大しにくい。サイヤジェン株式会社が納品する前に検証致しますので、再び検証される必要がありません。

電気泳動の結果

電気泳動を行った後で同時にストリップ1、ストリップ2があるなら、陽性マウスと判断する。

目的ストリップが出ないなら、陰性マウス（野生型或いは他の突然変異）と判断する。

シークエンシング

PCR同定の以外、産物のシークエンシングも必要である。F1/R1の拡大産物のシークエンシングプライマーはloxP部位に近い5’arm（図示F3）に設定する。F2/R2の拡大産物のシークエンシングプライマーはloxP部位に近い3’arm（図示R3）に設定する。

ホモ・ヘテロ遺伝子型の同定

プライマーの設計

F1世代マウスは出荷する時に既に相同腕ターゲットの正確性を検証された。1kb以下の目的断片を検証すればいい。ホモとヘテロを区別するために、ノックイン区域の上流・下流に位置するプライマーを一つ設計する。

予想される断片サイズ

ストリップ1のサイズ：F4/R4の拡大した野生型断片である。

ストリップ2のサイズ：F4/R4の拡大した挿入断片＋相同腕である。

ストリップ3のサイズ：F5/R4の拡大した一部の挿入断片＋相同腕である。

コメント：短い断片を使用するべきである。挿入する断片が大きすぎると、F4/R4が出ない可能性がある。

電気泳動の結果

電気泳動を行った後でストリップ3だけあるなら、若しくは同時にストリップ2もあるなら、陽性ホモマウス（KI/KI）と判断する。

電気泳動を行った後でストリップだけあるなら、野生マウス（+/+）と判断する。

電気泳動を行った後でストリップ1とストリップ3だけあるなら、若しくは同時にストリップ2もあるなら、陽性ヘテロマウス（KI/+）と判断する。

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