高度な計算ツールを用いてアミノ酸配列を変えずにPAM部位を破壊するサイレント変異を設計します。温度感受性の検証では、許容温度（permissive）と制限温度（restrictive）での増殖速度やタンパク質活性を測定する表現型アッセイを実施し、機能的シーケンス解析で補完します。例えば温度感受性BRAF変異体では、温度条件を変えた上でp-ERKのウェスタンブロットによりMAPK経路活性を評価します。

BRAF V600E の機能および MAPK経路の活性化は、主要な経路マーカーであるリン酸化ERK（p-ERK）に対するウェスタンブロット解析により確認しております。さらに、BRAF V600E 突然変異の特異的検証として、VE1抗体による染色を実施しております。これらの検証により、編集済み細胞が期待される経路活性化を示していることを確実にし、治療反応を正確にモデル化する上で不可欠な信頼性を確保しております。

当社のアプローチは、マルチプレックスgRNA設計と独自開発のα-donorシステムを組み合わせ、1つのエクソン内に複数の突然変異を同時に導入することを可能にします。正確な改変を確保し、隣接する調節領域への影響を回避するため、相同組換え（Homologous Recombination, HDR）を活用しております。編集後の確認には、Sangerシークエンシングおよび機能検証（例：TP53エクソン6の截断に対してCypDとの相互作用検査）を実施し、ゲノムの整合性を厳密に維持いたします。

当社は、細胞ストレスを最小化するために遺伝子改変コンポーネントの導入条件を最適化し、独自のα-donorシステムによるフットプリントフリー編集（footprint-free editing）を用いることで、多能性維持を最優先します。編集後の検証には、OCT4、NANOG、SOX2の免疫蛍光染色を含みます。標準レポートには免疫蛍光画像が含まれますが、ご要望に応じてステムネス検証のための定量的フローサイトメトリーデータも提供可能です。

はい。当社のターゲティング遺伝子編集技術を用いたCell Gene Editing Systemにより、MSIステータスを保持したままHCT116細胞に精密なKRAS G12Dホモ接合変異を導入できます。MSIの安定性は、標準化された大腸がん研究プロトコルに従い、PCR-キャピラリー電気泳動でBAT25およびBAT26を含む5つのマイクロサテライト座位を解析して検証します。これにより、編集過程で意図しないゲノム攪乱が生じていないことを保証します。