点変異細胞株

Q: 温度感受性バリアントを設計する際、PAM部位にサイレント変異を導入するアプローチは何ですか。温度依存的表現型はどのように検証しますか。

高度な計算ツールを用いてアミノ酸配列を変えずにPAM部位を破壊するサイレント変異を設計します。温度感受性の検証では、許容温度（permissive）と制限温度（restrictive）での増殖速度やタンパク質活性を測定する表現型アッセイを実施し、機能的シーケンス解析で補完します。例えば温度感受性BRAF変異体では、温度条件を変えた上でp-ERKのウェスタンブロットによりMAPK経路活性を評価します。

Q: メラノーマ細胞系におけるBRAF V600E突然変異に対して、編集後における下流のMAPK経路の活性化状態をどのように確認されていますか。Western blotによる検証は含まれていますか。

BRAF V600E の機能および MAPK経路の活性化は、主要な経路マーカーであるリン酸化ERK（p-ERK）に対するウェスタンブロット解析により確認しております。さらに、BRAF V600E 突然変異の特異的検証として、VE1抗体による染色を実施しております。これらの検証により、編集済み細胞が期待される経路活性化を示していることを確実にし、治療反応を正確にモデル化する上で不可欠な信頼性を確保しております。

Q: TP53遺伝子の同一エクソン内に複数の点突然変異を導入する際の手法はご指定いただけますか。また、周辺の調節領域に影響を与えることなく実現可能でしょうか。

当社のアプローチは、マルチプレックスgRNA設計と独自開発のα-donorシステムを組み合わせ、1つのエクソン内に複数の突然変異を同時に導入することを可能にします。正確な改変を確保し、隣接する調節領域への影響を回避するため、相同組換え（Homologous Recombination, HDR）を活用しております。編集後の確認には、Sangerシークエンシングおよび機能検証（例：TP53エクソン6の截断に対してCypDとの相互作用検査）を実施し、ゲノムの整合性を厳密に維持いたします。

Q: iPS細胞株において、遺伝子編集プロセス中に多能性マーカー（OCT4、NANOG）の維持に向けた戦略はどのようなものでしょうか。また、ステムネスの検証に向けたフローサイトメトリー解析データの提供は可能でしょうか。

当社は、細胞ストレスを最小化するために遺伝子改変コンポーネントの導入条件を最適化し、独自のα-donorシステムによるフットプリントフリー編集（footprint-free editing）を用いることで、多能性維持を最優先します。編集後の検証には、OCT4、NANOG、SOX2の免疫蛍光染色を含みます。標準レポートには免疫蛍光画像が含まれますが、ご要望に応じてステムネス検証のための定量的フローサイトメトリーデータも提供可能です。

Q: サイヤジェン (Cyagen)は、HCT116細胞でマイクロサテライト不安定性（MSI）ステータスを維持したまま、KRAS G12Dのホモ接合変異を実現できますか。編集後のMSI検証方法は何ですか。

はい。当社のターゲティング遺伝子編集技術を用いたCell Gene Editing Systemにより、MSIステータスを保持したままHCT116細胞に精密なKRAS G12Dホモ接合変異を導入できます。MSIの安定性は、標準化された大腸がん研究プロトコルに従い、PCR-キャピラリー電気泳動でBAT25およびBAT26を含む5つのマイクロサテライト座位を解析して検証します。これにより、編集過程で意図しないゲノム攪乱が生じていないことを保証します。

サイヤジェン (Cyagen)のターゲティング遺伝子編集技術を活用し、疾患特異性細胞株を迅速に構築可能です。6週間で検証済みの点突然変異を導入し、難易度の高い細胞株においても最大87％のHDR効率を実現。包括的な品質管理（QC）文書およびヘテロ接合クローンの保証により、信頼性の高い結果を提供いたします。

包括的な納品物

相同組換えを実現したヘモジゴス型クローンを、詳細な品質管理報告書とともにご提供し、2週間ごとに進捗状況をご連絡いたします。

短納期

最短6週間でヘテロ接合クローンの取得が可能です。

最適化 α-ドナー系

正確な点突然変異導入において、HDR効率を最大87％まで達成します。

ワークフロー

FAQs

ワークフロー

点変異細胞株：精密性と効率性の両立

サイヤジェン (Cyagen)のターゲティング遺伝子編集技術は、従来にない高い効率で正確なゲノム改変を実現します。当社が検証済みのプロトコールにより、多様な細胞株においてHDR効率87％、ヘモジゴス型変異獲得率70％を達成しました。これにより、包括的な品質検証を伴う迅速な疾患モデル構築および創薬スクリーニングが可能となります。

ワークフローと納品

当社の細胞株作製サービスは、遺伝子改変細胞株を作製するための包括的かつ効率的なワークフローを提供し、品質、再現性、および迅速な納品を実現します。以下に、各細胞株タイプについて、ご研究ニーズに応じたワークフロー、想定スケジュール、および納品内容の詳細を示します。

ポイントミューテーション細胞株の作製および納品

サイヤジェン（Cyagen）のポイントミューテーション細胞株作製ワークフローは、正確かつ効率的な遺伝子編集を実現します。初期設計から最終QCに至るまで、透明性が高く品質管理の徹底したプロセスを通じて、想定スケジュール内で信頼性の高いポイントミューテーション細胞株を提供します。

納品内容および品質管理

細胞種	代表的な細胞株	納品内容	品質管理（QC）
腫瘍細胞および免疫細胞	Jurkat、HepG2、SK-MES-1	ポイントミューテーションクローン＋対応するWTコントロール（各2バイアル、10⁶ cells/vial）＋検証レポート	PCR、サンガーシーケンシング
非がん性細胞	HK-2、AC16	ポイントミューテーションクローン＋対応するWTコントロール（各2バイアル、10⁶ cells/vial）＋検証レポート	PCR、サンガーシーケンシング

ワークフローおよびスケジュール

工程	説明	納期
細胞増殖およびQC	1. マイコプラズマおよび無菌試験。 2. 細胞増殖能の評価。 3. 標的領域シーケンシング用プライマー設計。	1～2週間

ガイド分子およびドナーベクター設計	1. 遺伝子ターゲティング用ガイド分子の設計および合成。 2. ドナーテンプレートの構築。	2～5週間
エレクトロポレーションおよびクローン選抜	1. 標的細胞へガイド分子をエレクトロポレーションにより導入。 2. 単一クローンをスクリーニングし、ゲノムDNAを抽出後、PCRおよびシーケンシングによりポイントミューテーションを検証。	4～6週間
凍結保存および最終QC	1. 変異部位の配列解析。 2. マイコプラズマおよび無菌試験。 3. 生存率試験。	1～2週間

注：

推定総期間：8～15週間
細胞種およびプロジェクトの複雑性に応じて期間は変動する場合があります。

iPS細胞ポイントミューテーション細胞株の作製および納品

当社のiPS細胞ポイントミューテーション細胞株作製プロセスは、細胞の多能性を維持しつつ高品質な遺伝子編集を実現するよう最適化されています。専用ワークフローと専門的管理体制により、お客様の研究に求められる厳格な基準を満たす、堅牢かつ検証済みのiPS細胞ラインを提供します。

納品内容および品質管理

細胞種	代表的な細胞株	納品内容	品質管理（QC）
iPS細胞ポイントミューテーション細胞株	H1、H9、iPS細胞	分化細胞株または未分化細胞株	PCR、サンガーシーケンシング、免疫蛍光染色（IF）

ワークフローおよびスケジュール

工程	説明	納期
細胞増殖およびQC	1. マイコプラズマおよび無菌試験。 2. 細胞増殖能の評価。 3. 標的領域シーケンシング用プライマー設計。	1～2週間
ガイド分子およびドナーベクター設計	1. 遺伝子ターゲティング用ガイド分子の設計および合成。 2. ドナーテンプレートの構築。	2～5週間
エレクトロポレーションおよびクローン選抜	1. 標的iPS細胞へガイド分子をエレクトロポレーションにより導入。 2. 単一クローンをスクリーニングし、ゲノムDNAを抽出後、PCRおよびシーケンシングによりポイントミューテーションを検証。	4～6週間
凍結保存および最終QC	1. 変異部位の配列解析。 2. マイコプラズマおよび無菌試験。 3. 生存率試験。 4. 多能性マーカーを確認するための免疫蛍光染色。	2週間