[Research Trend] Analyzing the Process of CAR T-Cell Therapy Research

CAR T細胞療法は、白血病やリンパ腫の治療において顕著な治療効果を挙げています。2012年には、急性リンパ性白血病にかかった7歳の少女エミリー・ワイトヘッドさんが世界で初めてCAR T細胞療法の治験を受けて回復しました。2017年には米国食品医薬品局（FDA）が世界初のCAR T細胞療法を承認しました。以降、この分野は革新的な研究の急速な発展期に入りました。2021年には中国で2つのCAR T細胞療法薬が販売承認され、1回の投与につき120万〜129万人民元（約20万米ドル）の価格が付けられ、世界的に注目を集めました。

本記事では、CAR T細胞療法の開発プロセスに焦点を当て、前臨床および臨床研究における各段階の重要性について考察します。

図 1. 世界で初めてCAR T細胞療法を受けて回復した白血病患者のエミリー・ワイトヘッドさんは、健康を保って9年が経過しています。 (出典: https://emilywhiteheadfoundation.org)

CAR T細胞療法とは？

キメラ抗原受容体（CAR）T細胞療法は、免疫細胞（T細胞）にがん細胞を見つけて破壊させるための細胞ベースの遺伝子療法です。CAR T細胞療法では、患者の血液を採取し、T細胞を単離・活性化してから遺伝子導入を行います（通常はウイルスを用いた導入ですが、標的型遺伝子編集技術も使用されることが報告されています）。これにより、T細胞表面にがん抗原を特異的に認識するCARを発現させます。最終的に、拡大培養したCAR T細胞を患者に再投与することでがん治療を目的とします。

図 2. CAR T細胞のがん治療プロセス (出典: https://www.malaghan.org.nz)

近年、CAR T細胞療法は注目の研究分野となっています。現在、多くの臨床研究は欧米および中国で行われており、主に第I相および第II相臨床試験が中心ですが、一部には販売済みの製品を含む第III相試験も進行しています。2017年以降に販売承認されたCAR T細胞療法製品を表1に示します。これらの製品は主に白血病、非ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫の治療に使用されています。中国では2021年6月と9月に、CD19を標的とするCAR-T製品がそれぞれ承認されました。

表 1. 販売承認済みCAR-T製品の一覧

CAR T細胞療法の開発プロセス

1. 標的の同定と選択

がん抗原には以下の3種類があります：

• 細胞系統特異的抗原：特定の細胞系統に発現するもので、B細胞系統特異的抗原であるCD19やCD20が該当します。
• がん特異的抗原（TSA）：がん細胞にのみ発現するため、がん免疫療法の理想的な標的です。
• がん関連抗原（TAA）：がん細胞で優先的に発現しますが、正常組織にも発現することがあります。現在、最も研究が進められている抗原タイプです。

安全性の観点から、CAR T細胞は正常細胞ではなく、がん細胞を特異的に攻撃するように設計される必要があります。したがって、がん細胞および組織で高発現し、正常組織では（ほとんど）発現しない標的を選択することが重要です。

固体がんの微小環境などによるCAR T細胞療法の効果制限のため、研究は血液腫瘍と固体がんの2つに分けられます。現在販売されている7つのCAR T細胞療法薬はすべて血液腫瘍を対象としていますが、血液腫瘍はがん全体の約10％を占めるに過ぎません。これは、血液腫瘍と固体がんにおけるCAR T細胞療法の研究難易度に大きな差があることを示しています。血液腫瘍研究で最も一般的に用いられる標的は、白血病およびリンパ腫を対象とするCD19です。次に多発性骨髄腫の治療研究で用いられるB細胞マaturing抗原（BCMA）があります。固体がんでは、Mesothelin、MUC1、GPC3などが研究されています。

図 3. 標的別CAR T細胞療法の臨床試験件数。[3] A. 血液腫瘍における標的研究；B. 固体がんにおける標的研究。

2. CAR分子設計

特異的免疫は病原体に対する体の3番目の防御ラインです。病原体が体内に侵入すると、リンパ球が抗体を産生し、一連の免疫応答が起こります。科学者たちは、抗原を特異的に認識する抗体の性質と、T細胞を活性化するT細胞受容体（TCR）の性質を組み合わせたのが、CAR分子設計の基本原理です。

現在、科学的研究では4世代のCAR分子構造が定義されています：

1. 1世代CAR分子は3つの部分から構成されます。1つ目は抗体由来の抗原認識単鎖可変断片（scFv）、2つ目は膜貫通領域、3つ目は内因性TCR由来の細胞内シグナル領域CD3ζ分子です。
2. 2世代CAR分子は1世代に追加で共刺激ドメインを有します。共刺激ドメインは膜貫通領域とCD3ζ分子の間に位置し、ドメインの種類によりCAR T細胞の活性化方向が異なります。現在FDA承認されているCAR T細胞製品はすべて、CD28または4-1BBの共刺激ドメインを有する2世代設計です。
3. 2つの共刺激構造を同時に持つCAR分子は3世代CARと呼ばれます。
4. 4世代CARはT細胞の機能を高める改良が加えられており、T細胞に追加のタンパク質（サイトカインなど）を産生させたり、追加の受容体を持たせたりします。

図 4. 1〜4世代CAR分子構造の模式図。[5]

CAR分子構築は、各世代のCAR構造を基に調整および最適化可能です：

• scFvの選択：scFv選択の焦点は特異性です。標的以外のタンパク質と交差反応がある場合、オフターゲット効果の確率が高まります。一般的にCAR分子は適切な親和性を持つ必要があります。高すぎても低すぎてもCAR T細胞の効果に影響するため、適切な親和性を持つCAR分子を同定するための実験設計が必要です。
• リンカー領域の最適化：リンカーはscFvの可変領域重鎖（VH）と軽鎖（VL）をつなぐ領域です。通常はグリシンとセリン残基の繰り返しから成るため、その長さに最適化の余地があります。
• ヒンジの選択：ヒンジ領域は抗原認識のための細胞外ドメインと膜貫通領域をつなぎ、細胞外ドメインと細胞膜の空間的位置に影響を与えます。この領域はscFvが抗原に結合できるようある程度の柔軟性を持つ必要があります。
• 共刺激ドメインの選択：異なる共刺激分子は異なる性質を持ちます。表2はノバルティス社のウェブサイトより、一般的な共刺激ドメインである4-1BBとCD28の違いを示しています。

表 2. 共刺激ドメイン4-1BBおよびCD28の機能

3. CAR T細胞の構築

CAR T細胞の構築は、安定発現細胞株の構築に似ています。ただし、T細胞は一般的に休止状態であるため、最初に活性化する必要があります。CAR分子およびベクターの設計後、CAR T細胞の構築を開始できます。

レンチウイルスを用いた遺伝子導入の場合、免疫細胞特有の性質から、T細胞への遺伝子導入に使用されるウイルスの純度は、一般的な安定発現株よりも高いことが求められます。一般的なCAR T細胞の構築法は以下の通りです：末梢血単核球（PBMC）を単離・活性化し、1〜2日後にレンチウイルスで形質導入を行い、その後CAR T細胞の拡大および同定を行います。

図 5. CAR T細胞構築プロセス

CAR T細胞のin vitro殺傷効果の評価

CAR T細胞のin vitro殺傷実験は通常、CAR T細胞と標的細胞を共培養し、一連の評価を行います。標的細胞の出所は2つあります。1つは抗原を自然に発現するがん細胞株、もう1つは人工的に構築された抗原を発現する安定発現細胞株です。安定発現株を人工的に構築する主な方法はレンチウイルス法です。ウイルスベクターを構築後、細胞（例：293T細胞）に形質導入し、細胞に自然な抗原を発現または過剰発現させます。

CAR分子が抗原を認識すると、T細胞のエフェクター応答（増殖、サイトカイン放出、代謝変化、細胞傷害性など）が誘導されます。CAR T細胞は主にグラニキシムおよびペルforinの分泌により細胞傷害機能を発揮すると考えられています。[4] サイトカイン（インターフェロンIFN-γ、インターロイキンIL-2など）は免疫応答を調整し、さまざまな抗がん機能を果たします。一般的なin vitro殺傷効果評価法には、T細胞増殖検出、殺傷実験（標的細胞の溶解度の検出）、サイトカイン検出などがあります。フローサイトメトリーは、さまざまな細胞集団を定量検出する有効な方法の1つです。細胞数測定試薬（Cell Counting Kit-8、CCK-8）、MTT、カロセイン、リアルタイム非標識細胞解析（RTCA）は殺傷効果の検出に使用できます。サイトカイン検出実験では、酵素免疫測定法（ELISA）とサイトメトリー・ビーズ・アレイ（CBA）の併用が一般的です。

CAR T細胞のin vivo抗がん活性の評価

一般的に、CAR T細胞研究のin vivoモデルには、がん細胞株由来キメラマウス（CDX）モデルまたはヒトがん患者由来キメラマウス（PDX）モデルが用いられ、さらに同系移植モデルやヒト免疫系再構築動物モデルも使用されます。CAR T細胞のin vivoのがん抑制効果のモニタリングには、in vivoイメージングがよく用いられます。そのため、ルシフェラーゼ-GFP標的細胞を構築し、緑色蛍光タンパク質を発現させることが一般的です。

標的細胞を接種してがんマウスモデルを構築した後、CAR T細胞を再投与し、その後の評価実験を行います。図6には、がんモデル構築に使用される代表的な免疫不全マウス、がん形成方法、CAR T細胞の再投与方法を示します。異なるがん形成方法は異なるメカニズム研究に適しています。たとえば、がんの転移研究には経路内接種が有効です。皮下のがん形成は直接観察可能で、がんの大きさを測定できます。原位接種は、がん発生の現実の環境を模倣できます。

図 6. CAR T細胞のin vivo機能評価

in vivo評価は主に、がんの成長モニタリング、マウスの生存状態、および毒性検出に焦点を当てます。マウスのin vivoイメージングは最も一般的な検出法の1つで、体内のがん細胞の成長を直感的に反映できます。同時に、in vivoにおける平均蛍光強度（MFI）もがん成長を評価する一般的な指標です。マウスの体重、毛並みの変化、生存期間、T細胞サブセットの増殖状態を定期的にモニタリングすることで、CAR T細胞の再投与が動物に与える影響を評価できます。

さらに、免疫組織染色やH&E染色などの病理検査により、CAR T細胞のがん細胞への浸潤度、または臓器・組織の病理的変化を多角的に評価できます。

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参考文献

[1] Li, C., Mei, H., & Hu, Y. (2020). Applications and explorations of 遺伝子編集技術 in CAR T-cell therapy. Briefings in functional genomics, 19(3), 175-182.

[2] Banerjee, S., Parasramka, M. A., & Paruthy, S. B. (2018). Garcinol: Preclinical Perspective Underpinning Chemo-and Radiosensitization of Cancer. In Role of Nutraceuticals in Cancer Chemosensitization (pp. 297-324). Academic Press.

[3] Wei, J., Guo, Y., Wang, Y., Wu, Z., Bo, J., Zhang, B., ... & Han, W. (2021). Clinical development of CAR T cell therapy in China: 2020 update. Cellular & molecular immunology, 18(4), 792-804.

[4] Larson, R. C., & Maus, M. V. (2021). Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells. Nature Reviews Cancer, 21(3), 145-161.

[5] Singh, A. K., & McGuirk, J. P. (2020). CAR T cells: continuation in a revolution of immunotherapy. The Lancet Oncology, 21(3), e168-e178.