[Weekly Model] Bbs5 Mice and New Research Progress

前記事では、バーデット・ビールズ症候群（BBS）に関連する遺伝子について紹介し、特にBBS5がコードするタンパク質の機能に注目しました。マウスモデルにおいて、研究者たちは何を明らかにしたのでしょうか？ BBS5ノックアウトまたはcKOがマウスに与える表現型への影響について、今週のモデル研究レビューで詳しく見ていきましょう。

変異型BBS5の病態メカニズムをさらに調べるため、Bentleyらは従来型のBbs5ノックアウト（KO）マウスモデル（Bbs5^-/-マウス）とBbs5インダイレクタルノックアウト（cKO）マウスモデル（Bbs5^flox/floxマウス）を同時に作成しました。研究の結果、Bbs5^-/-マウスの生存率が低下している一方で、繊毛の発生には影響がないことが示されました。Bbs5^-/-マウスは、頭蓋顔面の異常、骨格の短縮変形、脳室拡大、不妊、下垂体の異常、肥満など複雑な表現型を示します。Bbs5^flox/floxマウスにおいては、年齢を問わず肥満を引き起こしますが、男性不妊、脳室拡大、下垂体の異常は発生の初期段階でのみ観察されました。他のBBS遺伝子変異マウスモデルと比較して、BBS5変異に伴う下垂体機能の異常はBBS5に特有であり、下垂体を標的とした臨床的介入の新たな選択肢を提供します^[1]。

BBS5ノックアウトおよびインダイレクタルノックアウトマウスの作成

C57BL/6NTac由来のBbs5ノックアウトファースト（Bbs5^{tm1a(EUCOMM)Wtsi/+}；Bbs5^−/+）マウス胚性幹細胞をEucommより取得し、C57BL/6J胚盤胞へ注入することでBbs5^−/−（tm1a）系統を樹立しました。アレルはC57BL/6J系統で維持されました。Tm1cインダイレクタルアレルは、tm1aをFlpOリコンビナーゼマウス（C57BL/6J）と交配させ、LacZおよびNeoカセットを除去することで作成され、インダイレクタルアレル（tm1c；Bbs5^flox/flox）が得られました。次に、組換えアレルを保有する子をFlpO系統から交配除去し、Cagg-CreERT2雄（C57BL/6J）と交配させることでtm1d（Bbs5^Δ/Δ）アレルを作成しました。本稿では、これらのアレルをBbs5^−/−（tm1a）、Bbs5^flox/flox（tm1c）、Bbs5^Δ/Δ（tm1d）として記載します（図1A）。

図1. マウスアレル。（A）先天的ノックアウトアレル（Bbs5^−/−）、インダイレクタルフォロークアレル（Bbs5^flox/flox）、組換えアレル（Bbs5^Δ/Δ）におけるゲノムDNAを示す。エクソンは黒いボックス、LoxPサイトは紫色の矢印、FRTサイトは灰色の円で示される。灰色の矢印は、FlpOマウスを用いて次のアレルを作成したことを示す。緑の矢印は、Cre発現マウスを用いて次のアレルを作成したことを示す。（B）対照（WT）およびBbs5^−/−（KO）の腎臓、脳、精巣からのウエスタンブロット解析。（C）脳、精巣、腎臓のRT-PCR解析。KO1stアレルの標的領域の上流にエクソン2のフォワードプライマー、下流にエクソン6のリバースプライマーを配置。（D）（C）で示されたcDNAのシークエンス解析により、Bbs5^−/−脳および精巣では予期しないスプライシングが、一方でBbs5^−/−腎臓では野生型配列が確認された。（E）E18.5（左、χ²(2, N = 47) = 3.09, P > 0.05）およびP21（右、23のニワリから得られたN = 141）におけるWT、Bbs5^−/+、Bbs5^−/−個体の割合。ただし、離乳時のメンデル比は変異個体の観察数が有意に少ないことを示している（χ²(2, N = 141) = 19.93, P < 0.001）。（F）アセチル化α-チューブリン（Ac. Tub、紫色）およびArl13b（緑）で染色したMEFにおける免疫蛍光。核はHoechst（青）で染色。スケールバー = 20 μm。（G）対照（f/f）、ヘテロ接合（f/Δ）、Bbs5^Δ/Δ変異個体（Δ）の脳、腎臓、精巣cDNAから得られたBbs5エクソン2～6のRT-PCR解析。（H）cre陰性対照（f/f）およびBbs5^Δ/Δ変異（Δ）の腎臓、脳、精巣リジデートからのウエスタンブロット解析^[1]。

表現型の解析

Bbs5^−/−マウスには繊毛形成の障害がない

Arl13bおよびアセチル化α-チューブリンによる免疫染色の結果、解析した組織における一次繊毛の数および長さに顕著な差はなく、Bbs5^−/−マウスは繊毛形成に一般的な障害を示さないことが分かりました。さらに、Bbs5^−/−のマウス胚性繊維芽細胞（MEF）も、対照群と同程度の頻度および長さで繊毛を形成します（図1F）。繊毛の形態的異常が見られないことは、他のコアBBSーム変異マウスモデルとも一致しています。

Bbs5変異マウスにおける繁殖能力の障害

Bbs5^−/−変異マウスの繁殖能力を調べるため、ホモおよびヘテロ接合のマウスを交配させました。ヘテロ接合の雄および雌は繁殖可能ですが、Bbs5変異アレルのホモ接合の雄または雌が交配に用いられた場合、子は得られませんでした。この原因としてBbs5^−/−雄の不妊が考えられるため、精巣を単離し、組織学的染色を実施しました。Bbs5^−/−精巣では、鞭毛を持たない精子が確認されました（図2A）。さらに、変異マウスの副精巣から精子を抽出しても鞭毛を持つ精子は得られず、一方で野生型（WT）およびヘテロ接合マウスからは鞭毛を持つ精子が得られました。

図2. 精巣の解析。ヘマトキシリン・エオシン染色による（A）野生型およびBbs5^−/−マウス（先天的）、（B）若年期に誘導されたインダイレクタル（P7誘導）、（C）成人期に誘導されたインダイレクタル（8週誘導）精巣の染色。点線内（黄色）に鞭毛を持つ精子の存在が確認されるのはWTおよび成人誘導Bbs5^Δ/Δマウスであり、Bbs5^−/−および若年誘導Bbs5^Δ/Δマウスでは鞭毛を持つ精子が欠如している（スケールバー 0.1mm）^[1]。

精子の発生における障害が、鞭毛の維持ではなく発生段階にあるかをさらに調べるため、Bbs5^flox/flox; Cagg-Cre^ERT2マウスを用い、P7（性的成熟前）または8週齢（性的成熟後）でBbs5の欠損を誘導しました。P7で誘導され、少なくとも2か月後に解析されたBbs5^Δ/Δマウスの精巣では、8匹中5匹が鞭毛を持つ精子を形成せず、3匹は形成しました。鞭毛を持つ精子を形成した3匹のうち2匹では、その数が減少していました（図2B）。成人期（8週）に誘導された変異マウスを誘導後10週で解析したところ、すべてのBbs5^Δ/Δマウス（N = 5）に鞭毛を持ち運動性のある精子が確認されました（図2C）。この結果から、BBS5は精子形成の初期段階において発生的役割を果たすが、鞭毛の形成や維持には関与していないことが示唆されます。