[Research Trend] Inducible Humanized ACE2 Mouse Model For Coronavirus (COVID-19) Research

Technical Route

本研究では、生細胞内でウイルスのスパイク（S）蛋白質が受容体ACE2と結合する仕組みを探るために、研究者らはACE2の感染過程における重要性や、スパイク蛋白質のプロteolysisに必要な重要なアミノ酸の必要性を、細胞融合実験を用いて解析しました。ヒトACE2（hACE2）ノックインマウス由来の各種細胞株および一次細胞を用いた結果、ACE2蛋白質がウイルススパイクの加水分解を促進し、S2'断片を生成することが判明しました。この断片生成は、スパイク蛋白質が媒介する膜融合にとって重要な段階です。

Spike駆動による細胞融合はACE2存在下でのS2'断片生成と連動

生細胞内でスパイク（S）蛋白質が受容体ACE2と結合した際の機能的・生化学的特性を調査するため、研究者らは細胞間融合アッセイを用いて、合体細胞（syncytia）から得られる可能性のあるスパイク蛋白質の切断産物を同定しました。

スパイク発現HEK293T細胞にHEK293T-ACE2細胞を付加すると、合体細胞が形成され、そのリザイテからスパイク蛋白質産物を免疫沈降しました。その結果、制御群では検出されなかった約68kDaの追加バンド（S2'）が検出されました。さらに、このS2'バンドの発現強度はACE2発現細胞の添加数に依存しており、ACE2の発現量が増えるほどスパイク蛋白質のプロteolytic処理が促進されることを示しています。

図1. 本研究では、in vitroの細胞間融合系を用いて、S蛋白質がACE2と結合した際の酵素的切断および膜融合を解析しています^[1]。

S2'切断には機能的ACE2の認識が必須

以前の研究では、マウスACE2を発現する細胞は野生型SARS-CoV-2スパイク蛋白質による感染に対して抵抗性を示すことが示されています。そこで研究者らは、ヒトおよびマウスのACE2変異体がS2'断片生成に与える影響を比較しました。

Co-immunoprecipitation（Co-IP）実験の結果、マウスACE2蛋白質はスパイク蛋白質のRBDドメインに結合できないのに対し、ヒトACE2は結合可能であることが判明。さらに、ヒトACE2はスパイク蛋白質全長とも相互作用するのに対し、マウスACE2はその能力を持ちません。

一次細胞におけるスパイク駆動融合を模倣するため、研究者らはCyagenに依頼してH11座位にヒトACE2遺伝子をノックインしたマウスモデルを作成し、肺上皮細胞を単離しました。このノックインマウスは「K18プロモーター-Kozak-ヒトACE2 CDS-P2A-CreERT2-rBGpA」カセットを保有しており、ヒトACE2受容体とCreERt2を発現します。これにより、特定の組織で誘導されるホスト遺伝子（floxed）の機能をコロナウイルス感染に応じて調べることが可能です。C57BL/6J系統のK18プロモーター駆動hACE2-Cre-ERT2ノックイン（hACE2 KI）マウスはCyagenにより作成され、実験に使用されました。研究者らはS2'バンドの検出に加えて、合体細胞の形成を緑色蛍光で観察することに成功しています。

図2. S2'断片の生成には機能的ACE2による特異的認識が必要であることが示されています^[1]。

スパイク蛋白質のアルギニン815がS2'切断に必要

SARS-CoV-2スパイク蛋白質は複数の部位で切断可能であり、特にS1/S2ジャンクション（685番目）やS2'部位（815番目）のアルギニン残基は保存されています。これらの機能を調べるため、研究者らはこれらのアミノ酸をアラニンに置換する変異を作成しました。

実験の結果、HEK293T細胞でR815A変異を導入したスパイク蛋白質を発現させると、S2'への加水分解が不能となりました。このことから、スパイク蛋白質の815番目のアルギニンがS2'切断に必須であることが明らかになりました。

図3. スパイク蛋白質のアルギニン815がS2'切断に必要であることが示されています^[1]。

まとめ

上記の実験により、スパイク蛋白質の加水分解によるS2'蛋白質の生成がコロナウイルス感染において不可欠な分子イベントの一つであり、815番目のアルギニンがこの切断に必要であることが証明されました。

CyagenのACE2マウスモデル：コロナウイルス研究を支援

Cyagenは独自のTurboKnockout™技術および最適化された遺伝子編集技術を用いて、BALB/c、C57BL/6J、C57BL/6Nの3つの系統のACE2マウスモデルを作成しています。研究目的や用途に応じて、さまざまな遺伝子改変戦略を提供可能で、新型コロナウイルス研究者向けに検証データレポートも提供しています。今回開発されたC57BL/6J系統のK18プロモーター駆動hACE2-Cre-ERT2ノックイン（hACE2 KI）マウスは、今後の研究をさらに支援するプラットフォームとなります。新型コロナ研究関連のマウスモデルをご希望の場合は、お問い合わせください。

参考文献

[1] Shi Yu, Xu Zheng, Bingjie Zhou, Juan Li, Mengdan Chen, Rong Deng, Gary Wong, Dimitri Lavillette, Guangxun Meng, SARS-CoV-2 spike engagement of ACE2 primes S2′ site cleavage and fusion initiation. Proceedings of the National Academy of Sciences Jan 2022, 119 (1) e2111199119; DOI: 10.1073/pnas.2111199119

https://www.pnas.org/content/119/1/e2111199119