AAV9-Galns遺伝子治療がMPS IVAの病態を逆転

AAV9を介したGalns発現が骨格変化を抑制

MPSIVAラットにAAV9-Galnsを投与した結果、大腿骨、脛骨、上腕骨などの骨においてGalns発現が増加した（図4a）一方、成長板（GP）および皮質部（diaphysis）においてケラタン硫酸（KS）の蓄積が減少した（図4b–d）。

2か月齢のMPSIVAラットでは、GP軟骨断面においてGP面積および石灰化面積の両方で有意な減少が認められ、これは年齢に伴う骨化変化を反映するものであった（図4e）。MPSIVAラット脛骨GPの解析結果、静止帯および増殖帯の両方において軟骨細胞の肥大（hypertrophy）が観察されたが、AAV9-Galns治療を受けたMPSIVAラットでは軟骨細胞肥大が有意に減少した（図4f）。

透過電子顕微鏡（TEM）による分析でも、治療群ラットの増殖中軟骨細胞内における貯蔵小胞（storage vacuoles）が著しく減少していることが確認された（図4g）。これらの結果は、AAV9-Galns遺伝子治療を受けたMPSIVAラットにおいて観察された体形サイズの正常化とも一致していた（図3a,b）。

MPSIVAラット治療群は正常な骨密度および含量、トレイビキュラー（Trabecular）の厚さ、数、間隔を示したが、非治療群ではすべての骨パラメータが変化していた（図4h–j）。これらの結果は、本遺伝子治療がMPSIVA疾患の骨格病変を治療することを裏付ける強力な証拠である。

AAV9-Galnsベクター治療が歯科病変の予防

MPSIVA患者では、よく見られる歯科的異常が伴う。2か月齢のMPSIVAラットモデル（MPS）では、歯の咬合不正、脆弱性、エナメル形成不全（hypoplasia）が既に顕著であった（図5a）。一方、AAV9-Galnsで治療を受けたMPSIVAラットでは、正常な咬合とエナメルを持つ犬歯（incisor）が維持されていた（図5a）。

下顎（mandibular）断面における犬歯のリソソーム膜タンパク質-2（LIMP2）免疫染色の結果、MPSIVAラットの犬歯形成細胞（ameloblasts）および乳頭層（papillary layer）細胞においてリソソームの拡張が顕著であり、これがエナメル形成異常（dysplasia）を引き起こしていた（図5a,b）。AAV9-Galns治療により、これらの細胞の貯蔵病変が改善された（図5b）。MPSIVAラット犬歯の超微細構造解析結果、ameloblasts内に多数の貯蔵小胞が観察されたが、AAV9-Galns遺伝子治療により病的リソソーム蓄積が減少した（図5c）。

AAV9-Galns遺伝子治療による関節軟骨病変の治療

MPSIVA患者では、ケラタン硫酸（KS）蓄積により関節軟骨が影響を受け、重度の関節炎が発生し、長期的には整形外科手術を要する場合が多い。4週齢のMPSIVAラットにおいて、脛骨軟骨断面のサフラニン-O染色およびLIMP2免疫染色により、WTラットと比較して関節軟骨内においてすでに約2倍の軟骨細胞肥大の増加が観察され、早期の貯蔵病変を裏付けた（図6a–c）。8週齢のMPSIVAラットでは、進行的なKS蓄積およびリソソームの膨張により、関節軟骨内におけるLIMP2シグナルの増加が顕著であった（図6d–e）。AAV9-GalnsによるMPSIVAラット治療により、関節軟骨内での貯蔵病変が著しく改善された（図6d–e）。実際に6か月齢のMPSIVAラットの遠位大腿骨端（epiphysis）の分析結果、KS値は約4倍に増加したが、AAV9-Galns治療後には著しく低下した（図6f）。

6か月齢のMPSIVAラットの上腕骨軟骨断面を対象としたサフラニン-O染色による組織学的解析の結果、関節軟骨表面層に肥大した軟骨細胞の増加に伴い、関節炎様表現型が顕著であった（図6g）。AAV9-Galns治療は、この層における肥大軟骨細胞の数を減少させた（図6g）。

脛骨関節軟骨表面層の肥大軟骨細胞を対象とした超微細構造解析の結果、非治療群ラットと比較して、AAV9-Galns治療群ラットでは貯蔵小胞が観察されなかった（図6h）。また、MPSIVAラットにベクター投与後11か月経過した時点での膝関節において、関節軟骨損傷を防ぐために軟骨細胞の肥大が著しく減少していた（図6j–k）。これは関節軟骨内マトリックスメタロプロテイナーゼ13（MMP13）発現が正常に回復したのとも一致しており、関節炎予防に寄与する結果となった（補足図6l）。さらに、滑膜（synovial membrane）のリソソーム拡張現象もAAV9-Galns投与により正常に回復した（図6m）。滑膜の変化に伴い、MPSIVAラットは2か月時点から握力（grip strength）の低下を示した（図6i）。しかし、AAV9-Galns治療群MPSIVAラットはWTラットと類似した行動を示した（図6i）。これは、本遺伝子治療がMPSIVA疾患の関節炎変化を改善可能であることを示唆する。

AAV9-Galns治療による気管および心臓病変の改善

MPSIVA患者に見られる最も深刻な非骨格系症状は呼吸器および循環器合併症であり、これは死亡の主要な原因となることもある。MPSIVAラットでは、透明軟骨を有する気管組織および呼吸器上皮、ラミナプロピア（lamina propria）に変化が認められた。AAV9-Galns遺伝子治療を施行した結果、気管および肺においてGalns発現および活性が増加し、軟骨細胞、繊毛細胞、線維芽細胞内の貯蔵異常も正常に回復した（図7a–f）。また、呼吸器病変も正常に回復した。

同様の結果として、AAV9-Galns注射を受けたMPSIVAラットの心臓においてもGalns発現および活性が高まった（図7g）。しかし、Morquio患者の主な心臓異常は僧帽弁（mitral valve）異常である。透過電子顕微鏡（TEM）の結果、MPSIVAラットの僧帽弁において異常貯蔵が観察されたが（図7h）、AAV9-Galns治療群では僧帽弁細胞の貯蔵異常が正常に回復した（図7h）。

また、大動脈壁断面においてもリソソーム拡張現象がLIMP2免疫染色により確認され、AAV9-Galns遺伝子治療群ではこれらの変化が正常に回復した。AAV9-Galns治療群の大動脈線維の超微細構造解析結果、貯蔵小胞が全く観察されず、貯蔵異常が正常化されたことが証明された（図7i）。

MPSIVAラットの僧帽弁異常および大動脈壁変化は、患者に見られる心拍数増加を誘導するものと類似した結果を示した（図7j）。一方、AAV9-Galns遺伝子治療群では心拍数が正常に回復した（図7j）。