CAR-T開発におけるフローサイトメトリーの応用
キメラ抗原受容体T細胞（CAR-T）免疫療法は、遺伝子工学技術を用いて自己または同種のT細胞を腫瘍特異的抗原を標的にする新しいキラー細胞に変換するものであり、血液系悪性腫瘍の治療において顕著な成果を上げている。CAR-T細胞免疫療法の前臨床研究は、薬物開発において重要な段階であり、長期にわたるプロセスを含む。これには、標的抗原の同定、抗体開発、単鎖可変領域（scFv）のスクリーニング、CAR-T細胞の構築、in vitroにおけるCAR-T細胞の抗腫瘍活性評価、in vivoにおけるCAR-T細胞の抗腫瘍活性評価などが含まれる。
フローサイトメトリーは、液体中に懸濁された微小粒子を計数・分離する技術である。その高効率性、簡便性、正確性の高さから、CAR-T細胞療法のあらゆる分野で広く利用されている。ここでは、フローサイトメトリーがCAR-Tの前臨床開発においてどのように活用されているかを紹介する。
1. 標的抗原の発現検出
CAR-T細胞は腫瘍細胞表面の抗原に対するscFvを正確に認識し、殺傷作用を発揮するため、理想的な標的抗原のスクリーニングが重要なステップとなる。高特異性の標的抗原を選定するためには、すべての細胞における標的抗原の発現量を検出する必要がある。腫瘍細胞では高発現しているが、正常細胞では発現していない（または低発現）ような抗原を選定することで、CAR-T細胞療法に伴う毒性副作用を最小限に抑えることができる。このプロセスにおいてフローサイトメトリーは重要な応用を持つ。たとえば、以下の報告では、著者らがB細胞成熟抗原（BCMA）の発現分布をフローサイトメトリーにより検出した。その結果、BCMAは正常および腫瘍性プラズマ細胞（PC）で高発現していたが、正常組織では発現していない（または低発現）ことが明らかになった。
2. ウイルスタイターの検出
CAR-Tの臨床開発に先立ち、CAR-T細胞と抗原過剰発現を示す腫瘍細胞モデルの構築が必要となる。このため、対象配列をコードするレントウイルスを用いて、対応する細胞株に感染させ、安定した細胞モデルを効率的に構築する。このプロセスにおいて、レントウイルスのタイターは厳密に管理される必要がある。フローサイトメトリーは、レントウイルス活性のタイター検出における重要な手段の一つである。以下に、フローサイトメトリーを用いたレントウイルスタイター検出の応用例を紹介する。
CD19レントウイルスタイターのフローサイトメトリー検出
CD19抗原をコードする純化されたレントウイルスを、事前に接种した293T細胞に0.01、0.1、1、10 μlの4段階で添加する。72時間後に293T細胞をフローサイトメトリーで分析し、CD19抗原陽性率（すなわち、レントウイルスに感染した293T細胞の全細胞数に対する割合）を検出する。その後、以下の式に基づき、レントウイルスのトランスダクションタイターを算出する。
図に示すように、トランスフェクションウイルスの勾配が増加するにつれて、CD19抗原陽性細胞の数が段階的に増加しており、レントウイルスの感染活性が良好であることが示された。上記式に基づき、ウイルスタイターを算出した結果、1.4×108 Tu/mlであった。
同様に、FMC63 CARレントウイルスのタイターも上記方法により検出され、算出されたタイターは約4.33×108 Tu/mlであった。
3. CAR-T細胞のフェノタイプおよびCAR陽性率（または抗原過剰発現細胞モデルの抗原陽性率）の解析
構築されたCAR-T細胞に対して、機能検証の前に、フェノタイプおよびCAR分子の感染率を検証する必要がある。フローサイトメトリーは、CAR-T細胞表面のマーカー蛋白質および全細胞におけるCAR分子の陽性率を効果的に検出できる。同様に、抗原過剰発現細胞モデルにおいても、フローサイトメトリーを用いて抗原発現を検出できる。以下に、フローサイトメトリーがCAR-T細胞のフェノタイプおよび細胞陽性率検出においてどのように応用されているかの実例を紹介する。
▶ T細胞のフェノタイプおよびCD19 CAR-T細胞の陽性率の検出
2つの方法で調製したT細胞のフェノタイプを抗体を用いて分析した。その結果、両方法とも高純度のT細胞を得ることができたが、それぞれの方法で増幅されたT細胞サブタイプの割合は大きく異なっていた。Method1で増幅されたT細胞は主にCD8+T細胞サブタイプであったのに対し、Method2ではCD8+T細胞とCD4+T細胞の割合に差が小さいT細胞集団が増幅された。このT細胞サブタイプの役割は、研究の基盤を確立する。
同時に、Method1で増幅したT細胞にCD19 CARレントウイルスをトランスフェクションし、CD19 CAR-T細胞を構築した。その後、フローサイトメトリーを用いてCAR蛋白質の発現効率を検証した。その結果、CD19 CAR-T細胞の陽性率は45.59%に達したことが確認され、CD19 CAR-T細胞の成功的な構築が示された。
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図4. T細胞のフェノタイプ解析およびFMC63 CAR-T細胞陽性率検出結果。
A. PBMCの活性化・増殖10日目におけるT細胞の割合およびフェノタイプ解析結果。
B. FMC63 CAR-T細胞におけるCAR陽性率検出結果。（データ提供：Cyagen）
▶ プロセス品質管理用CD19-293T細胞株の構築
293T細胞にCD19レントウイルスを感染させ、CD19を恒常的に発現する293T細胞株を構築した。フローサイトメトリーを用いて、その抗原CD19の高発現を検出した。
4. CD19 CAR-T細胞のin vitro殺傷効果の検出
CAR-T細胞と腫瘍細胞、または抗原過剰発現細胞モデルを混合し、後者の死滅率を検出することで、CAR-T細胞の殺傷効果を評価できる。特に、腫瘍細胞のアポトーシスはフローサイトメトリーによって検出可能である。以下の例では、Nalm6細胞とCD19 CAR-T細胞およびT細胞を異なる効果対標的比で共培養し、48時間後、腫瘍細胞のアポトーシスをフローサイトメトリーで検出した。図に示すように、T細胞群（対照群）と比較して、CD19 CAR-T細胞は異なる効果対標的比条件下でNalm6細胞に対する特異的な細胞傷害効果を顕著に示した。また、細胞培養上清中のサイトカイン含量検出結果も、腫瘍細胞と共培養後のCD19 CAR-T細胞のIFN-γ分泌量がT細胞群に比べて顕著に増加していることを示した。
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図6. CD19 CAR-T細胞によるNalm6腫瘍細胞の殺傷効果検出結果。
A. Nalm6細胞表面におけるCD19抗原陽性率の検出結果。
B-C. FMC63 CAR-T細胞によるNalm6腫瘍細胞の殺傷効果および上清中サイトカイン検出実験結果。（データ提供：Cyagen）
5. in vivoにおけるCAR-T細胞の治療効果のモニタリング
CAR-T細胞のフェノタイプおよび殺傷効果をin vitroで確認した後、in vivo実験を行うことができる。CAR-T細胞を腫瘍マウスモデル（例：NSG、C-NKG、NOGなど）に投与し、異なる日時の末梢血（PB）サンプルを採取してフローサイトメトリーで分析することで、CAR-T細胞の増殖活性、細胞フェノタイプ、および殺傷能力をin vivoでモニタリングできる。
6. 結論
CAR-T療法は、腫瘍治療分野において最も有望な技術の一つであり、「がんを治癒可能」な治療法として、進行性リンパ腫および白血病の根治能力を示している。その前臨床研究は多くの重要なステップを経る必要があり、各ステップには厳密な品質管理基準が求められる。フローサイトメトリーは既にその利点と特徴を発揮しているが、近年の関連技術の進展に伴い、今後もCAR-T細胞療法の研究開発のあらゆる分野でさらに広く活用されていくだろう。
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CAR-Tおよびその他の細胞療法の前臨床研究において、細胞モデルおよび動物モデルの選定は極めて重要である。研究の目的を明確にし、効果的な実験モデルおよび研究プロトコルを構築することで、研究の効率を高めることができる。Cyagenは、抗体スクリーニングから安定株の構築、細胞／動物モデルの確立、薬効評価までをカバーする、細胞療法のワンストップサービスを提供しており、CAR-Tおよびその他の細胞療法の研究開発プロセスをより迅速に推進できる。詳細については、お問い合わせください。
| ウイルスベクター製造 | 免疫モデルの構築 | in vitro薬効評価 | in vivo薬効評価 |
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参考文献
Bu DX, Singh R, Choi EE, et al. Pre-clinical validation of B cell maturation antigen (BCMA) as a target for T cell immunotherapy of multiple myeloma. Oncotarget. 2018;9(40):25764-25780.
