眼疾の遺伝的要因：網膜色素変性症（RP）とRHO遺伝子
遺伝子は眼疾患の発症において重要な役割を果たしており、その多くは小児および成人においても頻度が高く、視覚障害の主要原因となる。小児期の失明の60％以上は遺伝的要因によって引き起こされ、先天性緑内障、眼形成異常、視神経萎縮、レチナ色素変性などが代表的である。成人においても、遺伝的要因は緑内障や加齢性黄斑変性など深刻な眼疾患と関連している。
Cyagenが過去15年間で培ってきたマウスモデル開発の経験を踏まえ、レチナ色素変性の研究に用いられるRhoノックアウト（KO）マウスの開発を実施。さらに、遺伝子疾患の研究においてより有用なヒューマナイズドマウスモデルの開発も継続しており、眼疾患および眼科研究に向けたモデルの提供を進めている。以下では、眼疾患および眼科研究に特に有用な代表的なヒューマナイズドマウスモデルについて紹介する。
レチナ色素変性とは？
レチナ色素変性（RP）は、臨床的・遺伝的に多様性を持つ失明を引き起こす網膜疾患であり、遺伝性網膜変性症の大きなグループに属する。現在までに54の網膜関連遺伝子の変異が同定されており[1]、本疾患は網膜のロッド光受容体の障害に起因する進行性の夜間視力障害（夜盲症）から始まり、周辺視野の徐々な喪失を経て、最終的にコーン光受容体の変性により全盲に至る。
図1. レチナ色素変性とは？（出典：Fleetwood Family Eye Care）
世界的に見ると、レチナ色素変性の有病率は約1/3,500であり、常染色体優性（adRP）、常染色体劣性（arRP）、X連鎖（XlRP）、二遺伝子性（digenic）のいずれかの形で遺伝する[2]。現在までに少なくとも20の遺伝子がadRPの原因とされており、そのタンパク質産物は網膜光受容体の構造や代謝に多様かつ重要な役割を果たしている。具体的には、外側セグメントのディスク形成、光転換反応、レチノイドサイクル、遺伝子発現、転写、mRNA処理などである[3]。
| タイプ | マッピングされた領域（未同定） | マッピング済みかつ同定された遺伝子 |
|---|---|---|
| 常染色体優性レチナ色素変性（adRP） | RP63 | ADIPOR1, ARL3, BEST1, CA4, CRX, FSCN2, GUCA1B, HK1, IMPDH1, IMPG1, KIF3B, KLHL7, NR2E3, NRL, PRPF3, PRPF4, PRPF6, PRPF8, PRPF31, PRPH2, RDH12, RHO, ROM1, RP1, RP9, RPE65, SAG, SEMA4A, SNRNP200, SPP2, TOPORS |
| 常染色体劣性レチナ色素変性（arRP） | RP22, RP29 | ABCA4, AGBL5, AHR, ARHGEF18, ARL6, ARL2BP, BBS1, BBS2, BEST1, C8orf37, CERKL, CLCC1, CLRN1, CNGA1, CNGB1, CRB1, CWC27, CYP4V2, DHDDS, DHX38, EMC1, ENSA, EYS, FAM161A, GPR125, HGSNAT, IDH3B, IFT140, IFT172, IMPG2, KIAA1549, KIZ, LRAT, MAK, MERTK, MVK, NEK2, NEUROD1, NR2E3, NRL, PCARE, PDE6A, PDE6B, PDE6G, POMGNT1, PRCD, PROM1, PROS1, RBP3, REEP6, RGR, RHO, RLBP1, RP1, RP1L1, RPE65, SAG, SAMD11, SLC7A14, SPATA7, TRNT1, TTC8, TULP1, USH2A, ZNF408, ZNF513 |
| X連鎖レチナ色素変性（XlRP） | RP6, RP24, RP34 | OFD1, RP2, RPGR |
表1. レチナ色素変性（RP）に関連するマッピング済み・同定された遺伝子 [1]
（出典：RetNet、Retinal Information Network）
Haimらの研究によると、adRPの有病率は全非特異的RP症例のうち8.4％、arRPが19％、X連鎖型が14.3％[4][5]。adRPの原因となる最も一般的な単一遺伝子はロドプシン（RHO；MIM#180380）であり、全症例の8～10％を占めており、これまでに130以上の変異が同定されている[6][7]。
表2. レチナ色素変性（RP）における遺伝形式の分布 [4]
RHO遺伝子の概要
RHO（ロドプシン）はタンパク質コード遺伝子である。ロドプシンタンパク質は、眼の後部にあるロッド細胞に存在し、低光量下での視覚に不可欠な役割を果たす。網膜という光感受性組織の一部であるロッド細胞は、暗所視を担う。網膜には他にコーン細胞と呼ばれる光受容細胞があり、明るい光下での視覚に寄与している。ロドプシンタンパク質（RHO）は、ビタミンAの一種である11-シスレチナールと結合している。光がこの分子（11-シスレチナール）に当たると、ロドプシンが活性化され、一連の化学反応が誘発され、電気信号が生成される。この信号は脳に伝達され、視覚として認識される。
図2. RHO遺伝子の情報および配列相同性アラインメント [8]
出典：レア疾患データセンター（RDDC）
常染色体優性レチナ色素変性（ADRP）とRHO遺伝子
現在までに、レチナ色素変性（RP）患者に150種類以上のRHO遺伝子変異が同定されている。RHO遺伝子変異は、常染色体優性RPの20～30％を占めており、本疾患の最も一般的な形態とされている。まれに、RHO遺伝子の変異は常染色体劣性RPと関連するが、このタイプの疾患は通常、他の遺伝子の変異によって引き起こされる。
RHO遺伝子変異の多くは、ロドプシンタンパク質の折りたたみや輸送に影響を及ぼす。一部の変異は、光に応じて活性化されるのではなく、恒常的に活性化された状態を引き起こす。研究により、変異したロドプシンは細胞の基本的機能を妨げ、ロッド細胞が自己破壊（アポトーシス）を引き起こすことが示されている。ロッド細胞は暗所視に不可欠であるため、その喪失は進行性の夜盲症を引き起こす。
レチナ色素変性は、コーン細胞の徐々な喪失とも関連しており、通常は明るい光下での視覚を担う。コーン細胞の死は、トンネル視を引き起こし、多くの患者で最終的に全盲に至る。一方で、RHO遺伝子の変異がコーン細胞の機能および生存にどのように影響するかは、依然として不明である[9]。
ヒューマナイズドRHOマウスモデル
RHO遺伝子の変異によるADRPは100種類以上存在し、北米で最も頻度が高いのはP23H（プロリン23がヒスチジンに置換）である。これは最初に同定されたRPの変異であり、in vitroおよび動物モデルにおいて広く研究されてきた。近年、T17M、P23HなどのRHOヒューマナイズドマウスモデルが開発され、ヒトの体内系におけるターゲット遺伝子編集療法の前臨床評価が可能となった。ただし、既知のRHO変異の数に対してヒューマナイズドマウスモデルはまだ少数であり、各変異に対してマウスモデルを構築するのは時間とコストがかかる。
ある研究では、Xiaozhen Liuらは、ホモロジー指向修復戦略とターゲット遺伝子編集Proを組み合わせ、マウスのエクソン1（mE1）から停止コドン直前のmE5までをヒト由来の遺伝子断片に置換し、すべてのイントロンをヒト由来に置き換える手法を用いた。これにより、ヒトロドプシンは内因性マウスプロモーターの制御下で、転写および翻訳が行われ、体内で発現した。未変異ヒトロドプシンは、ヒト化マウス線においてマウスロドプシンと同等の形態的・機能的置換が可能であった。一方、T17M、G51D、G114R、R135W、P171Rの5つの変異を含むヒトロドプシンを発現する変異型ヒト化マウス（Mut-Rhowt/humおよびMut-Rhohum/hum）では、網膜変性が観察された[10]。
図3. ヒューマナイズドRHOマウスの構築戦略 [10]
Mut-Rhohum/humマウスは、3か月齢で重度の網膜変性を呈し、ロッド外側セグメントの形成障害が認められ、視覚誘発電位（ERG）が記録不能であった。一方、Mut-Rhowt/humマウスは、光感応性ERG応答の低下が7か月齢で有意に認められ、3か月齢から外側核層の薄化と外側セグメントの短縮が観察された。7か月から9か月の間に、光感応性ERG応答の著しい異常および光受容体の喪失が顕著となり、12か月齢では、光感応性および明るさ感応性ERG応答の統計的低下と、網膜全体にわたる網膜変性が確認された。
本研究で提示された変異型ヒト化ヘテロ接合体戦略は、5つの変異に対するターゲット遺伝子編集療法の前臨床評価を、時間的・経済的に効率的に行う可能性を示している。
Cyagenが提供できるサービス
過去1年間、Cyagenは眼科遺伝治療モデル開発プラットフォームの構築に注力している。本プラットフォームは、眼科疾患研究のためのワンストップソリューションを提供することを目的としており、眼疾患モデルの構築からAAV注射、in vitroおよびin vivo薬理動態評価までを包括する。
Cyagenノックアウトカタログモデル
Cyagenノックアウトカタログモデルは、数千種類の遺伝子ノックアウト（KO）マウスおよび条件付きノックアウト（cKO）マウスを提供している。Rhoノックアウトマウスの即時利用も可能であり、カスタムモデルの開発も行っている。今後の研究に向けたモデル戦略について、専門家がご相談に応じます。お気軽にお問い合わせください。
参考文献：
[1] RetNet. 利用可能：http://www.sph.uth.tmc.edu/Retnet. 2015年10月アクセス。
[2] Rivolta C, Sharon D, DeAngelis MM, Dryja TP. Retinitis pigmentosa and allied diseases: numerous diseases, genes, and inheritance patterns. Hum Mol Genet. 2002 May 15;11(10):1219-27. doi: 10.1093/hmg/11.10.1219. Erratum in: Hum Mol Genet. 2003 Mar 1;12(5):583-4. PMID: 12015282.
[3] Hims MM, Diager SP, Inglehearn CF. Retinitis pigmentosa: genes, proteins and prospects. Dev Ophthalmol. 2003;37:109-25. doi: 10.1159/000072042. PMID: 12876833.
[4] Haim M. x. 2002;(233):1-34. doi: 10.1046/j.1395-3907.2002.00001.x. PMID: 11921605.
[5] Wright AF, Chakarova CF, Abd El-Aziz MM, Bhattacharya SS. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nat Rev Genet. 2010 Apr;11(4):273-84. doi: 10.1038/nrg2717. PMID: 20212494.
[6] Briscoe AD, Gaur C, Kumar S. The spectrum of human rhodopsin disease mutations through the lens of interspecific variation. Gene. 2004 May 12;332:107-18. doi: 10.1016/j.gene.2004.02.037. PMID: 15145060.
[7] HGDB-Cardiff. 利用可能：http://www.hgmd.org. 2015年10月アクセス。
[8] RDDC. 利用可能：https://rddc.tsinghua-gd.org/details/gene?gene=xnEBPG.
[9] GeneCards. 利用可能：https://www.genecards.org
[10] Xiaozhen Liu, Ruixuan Jia, Xiang Meng, Ying Li, Liping Yang,
Retinal degeneration in humanized mice expressing mutant rhodopsin under the control of the endogenous murine promoter, Experimental Eye Research, Volume 215, 2022, 108893, ISSN 0014-4835, https://doi.org/10.1016/j.exer.2021.108893.
