従来型遺伝子標的法によるノックアウトマウスの開発プロセス
最初のノックアウト（KO）マウスが作成されて以来、科学者たちは著しい進歩を遂げました。現在、ターゲット遺伝子編集技術は、その短いターンアラウンド時間の利点から、遺伝子ノックアウト研究において主流の手法となっています。本動画で解説されている従来型胚性幹細胞（ES細胞、ESC）を用いた技術は、プロジェクト完了までに8～12か月を要するという点で、もはや時代遅れと言えるでしょう。本動画では取り上げられていませんが、Cyagen独自の「TurboKnockout™遺伝子標的化サービス」は、従来型ES細胞を用いた標的化技術に基づいており、C57BL/6またはBALB/cマウスモデルを最短6か月で提供可能です。
従来型ES細胞を用いた遺伝子ノックアウトマウスの作成プロセスについて、詳しく学ぶために最新の動画をご覧ください。この技術は、幅広い遺伝子研究およびヒト疾患研究において活用されています。
動画：ノックアウトマウスとは？
注：本動画内で提示される割合については、正確な数値とは限りません。たとえば、ベクターの標的化効率は遺伝子座やベクターの種類によって大きく異なるため、10％はあくまで平均的な目安値です。
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最初のノックアウトマウスの確立
1981年、マーティン・J・エヴァンズ博士はマウスの胚性幹細胞を培養することに成功し、ゲノムが改変された生きているマウスの作成に道を開きました。この進展を受けて、マリオ・カペッキとオリバー・スミスイーズは、特定の遺伝子を不活性化した生きているマウスを交配により作成し、1989年に初めてのノックアウトマウスモデルを確立しました。この功績により、カペッキ、スミスイーズ、エヴァンズの3氏は2007年にノーベル賞を受賞しました。
ノックアウトマウス作成の従来型遺伝子標的化法
ノックアウトマウスの作成にはいくつかの方法がありますが、本動画では最初のノックアウトマウスモデルに用いられた従来型遺伝子標的化法に焦点を当てます。この方法では、胚性幹細胞（ES細胞またはESC）が用いられます。
このモデルは、C57BL/6マウスの胚性幹細胞から始まります。受精後約4日目に形成されるblastocystは、外側のtrophoblastと内側の内細胞塊（embryoblast）の2つの主要な細胞種から構成されています。embryoblastから細胞が分離されると、それらは胚性幹細胞と呼ばれます。まず、黒色マウス胚からembryoblastを採取し、特別な幹細胞培地に植え付けて分離・増殖させます。このようにして胚から分離された細胞が、胚性幹細胞と呼ばれます。
標的ベクターの設計と導入
研究者は、標的DNA構造を含む特定のベクターを作成し、それらにネオマイシンリンホストランスフェラーゼ（neor）遺伝子を導入します。neor遺伝子は、ネオマイシンという一般的な抗生物質に対して細胞を耐性化させるタンパク質をコードする遺伝子です。ただし、この遺伝子がホモロガス再結合によって幹細胞ゲノムに完全に統合された場合にのみ、耐性が発現します。
電穿孔によるトランスフェクション
科学者たちは、電気穿孔装置（electroporator）を用いて高電圧の電界を加え、胚性幹細胞のリン脂質二重層膜に一時的な穴を開けます。これにより、neor遺伝子を含むベクターが細胞膜を通過して細胞内に導入され、細胞の損傷を最小限に抑えます。しかし、電穿孔法は極めて非効率であり、ベクターが細胞膜を通過する細胞はごくわずかです。
ホモロガス再結合によるキャッセトル交換
ベクターが胚性幹細胞に導入された後、ホモロガス再結合が起こります。このプロセスにより、ネオマイシン耐性の獲得と同時に、目的遺伝子の完全なノックアウトが実現する可能性があります。ホモロガス再結合とは、類似または同一のDNA分子間で遺伝情報が交換されるプロセスであり、減数分裂の前期Iに起こります。この場合、目的遺伝子の両側に、ベクターゲノムと同一の配列を有する2つの相同エクソンが存在するため、再結合が可能となります。
ホモロガス再結合の効率
ホモロガス再結合は100％の効率で進行するわけではなく、結果として、遺伝子の部分的ノックアウト、完全なノックアウトに失敗した細胞、目的遺伝子の上流または下流にneor遺伝子がランダムに統合された細胞、そして目的遺伝子が完全にneor遺伝子に置換された完全ノックアウト細胞が混在することになります。
完全ノックアウト細胞の同定
この時点で、完全にノックアウトされた細胞とそうでない細胞が混在しています。科学者たちは、どの細胞がノックアウトを完了しているかを特定する必要があります。ネオマイシンを含む培地を使用することで、ネオマイシン耐性を持つ細胞、または電穿孔に失敗した細胞、部分的な再結合を起こした細胞は死滅します。
残存細胞の約90％は、目的遺伝子の上流または下流に耐性遺伝子がランダムに統合された状態であり、残りの約10％が完全ノックアウトを達成した細胞です。これらの細胞のうち、どのものがノックアウトであるかを特定するためには、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびサザンブロット解析が必要です。
チューリック（F0）マウスの生成
遺伝子改変された胚性幹細胞を培地中から回収し、受精したマウス胚（blastocyst段階）にマイクロインジェクションで注入します。このblastocystは、両親とも野生型の白マウス同士の交配によって作成されています。この受胎母体から生まれた多色の子は「キメラ」とも呼ばれるF0マウス（ドナー）と呼ばれ、異なる遺伝的背景を持つ2種類の細胞から構成されています。このマウスの黒い毛は、ノックアウトに対してヘテロ接合のES細胞由来であり、白い毛は野生型アレルに対してホモ接合の細胞由来です。
F0マウスの交配によるヘテロ接合およびホモ接合ノックアウトマウスの生成
このキメラ動物を白マウスと交配させると、子は完全に黒い個体または完全に白い個体になります。完全に黒い個体は、非モザイクヘテロ接合後代（F1マウス）と呼ばれ、遺伝子ノックアウトがヘテロ接合状態で存在します。ノックアウト表現型を発現させるには、ホモ接合状態が必要です。ホモロガス再結合とは、類似または同一のDNA分子間で遺伝情報が交換されるプロセスであり、減数分裂の前期Iに発生します。
ホモ接合ノックアウトマウスを得るためには、2匹のF1マウスを交配させます。単純なペニットスクエアを用いることで、これらのヘテロ接合個体間の交配後代を予測できます。その結果、4匹中1匹がホモ接合ノックアウト（完全ノックアウト）となり、表現型が完全に発現します。PCRおよびDNA配列解析により、どのマウスがホモ接合、どのマウスがまだヘテロ接合であるかを判別できます。
研究用即時利用型ノックアウトマウスモデル
Cyagenのノックアウトカタログモデルライブラリが設立されて以来、世界中の研究者に、最短3か月で即時利用可能なヘテロ接合ノックアウト（KO）マウスを提供してきました。標準的な供給品に加え、需要の高まりに応じて、ホモ接合系の交配サービスも開始しました。
ホモ接合ノックアウト（KO）系統は、遺伝子ノックアウトによる表現型効果を明確に把握するだけでなく、胚発生に必須な遺伝子の同定にも貢献します。これは発生生物学において極めて重要な領域です。当然ながら、多くの研究者からホモ接合系が胚発生に悪影響を及ぼす可能性への懸念が寄せられています。ヘテロ接合およびホモ接合KO系統を併用することで、ヒトの発生障害の評価に最適なツールが得られ、新たな診断法および治療法の開発を大幅に促進することが可能です。
Cyagenノックアウトカタログモデルのホモ接合系無料提供キャンペーン
2022年5月31日までにノックアウトカタログモデルを注文いただくと、ホモ接合系の供給へ無料アップグレード（価値3,450米ドル）を受けることができます。見積もり依頼時にプロモーションコード「HOMO22」をご記入ください。
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