トランスサブレチンアミロイドーシス治療薬開発におけるhTTRおよびhTTR V50M人為化マウスの価値
RNAi療法のリーディング企業であるAlnylamは、2023年の業績を公表し、トランスチレチン（TTR）を標的とする2種類のsiRNA薬（パチシランおよびブトリシラン）が合計9億1300万ドル以上の売上を達成したと報告した[1]。世界中でトランスチレチンアミロイドーシス（ATTR）の患者は25万～55万人と推定されており、その中でも特にATTR心筋症（ATTR-CM）の患者数が多いため、臨床的課題が深刻である[2]。現在、パチシランおよびブトリシランはATTR多発神経障害（ATTR-PN）に対してのみ承認を受けている。そのため、AlnylamはパチシランおよびブトリシランがATTR-CMに対して有効かどうかを評価する臨床試験を進行中である。同時に、多数の製薬企業がTTRを標的とする治療薬の開発に取り組んでおり、小分子核酸、小分子薬、抗体、遺伝子編集療法などを含む多様なアプローチが進展しており、ATTR治療におけるTTR標的薬開発の競争が顕著に高まっている。
図1：トランスチレチンアミロイドーシス（ATTR）の病態および臨床像 [3]。
TTRタンパク質とトランスチレチンアミロイドーシス（ATTR）
遺伝性アミロイドーシスの代表的なタイプはATTRであり、TTRタンパク質の遺伝子配列に病的変異（変異）が生じることによって引き起こされる致死性疾患である。正常状態ではTTRタンパク質は血中でテトラマーの形態をとり、甲状腺ホルモンおよびレチノール結合タンパク質の輸送を担っている。ATTR患者ではTTRタンパク質が誤折りたたみ、アミロイド様物質に重合し、心臓、神経、腎臓などの臓器に沈着することで臓器機能障害、不全、さらには死亡を引き起こす[4]。TTR遺伝子に変異があるかどうかにより、ATTRは遺伝性（変異型、ATTRv）と非遺伝性（野生型、ATTRwt）に分類される[5]。
図2：ATTRwtとATTRvの発症頻度および臨床像の違い [6]。
ATTRvはTTR遺伝子に病的変異が存在する遺伝性疾患であり、20～80歳の任意の年齢に発症する可能性がある。これらの変異によりTTRタンパク質がテトラマー構造から解離し、モノマー化した後に誤折りたたみ、アミロイド様物質に重合し、心臓、神経、腎臓などの臓器に蓄積する。一方、ATTRwtはTTR遺伝子に変異はなく、加齢に伴う恒常性維持機構の失調によって引き起こされる。老化に伴う要因によって野生型TTRタンパク質が変異型TTRと同様に誤折りたたみを起こす。ATTRwtは進行が緩やかな疾患であり、通常65歳以降に発症するため、「老人性全身アミロイドーシス」とも呼ばれている。
TTR遺伝子およびタンパク質を標的としたATTR治療戦略
ATTRに対する治療薬開発は、TTRタンパク質の合成を阻害すること、TTRタンパク質のテトラマー構造を安定化すること、または誤折りたたみTTRを除去することに焦点を当てている[7]。これらのアプローチの中で、小分子核酸および遺伝子編集が特に注目されている。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）および小分子干渉RNA（siRNA）製剤は、変異型および／または野生型TTRタンパク質の合成を効果的に抑制でき、患者の病態改善が確認されており、多くの製剤が承認・市販されている。また、ターゲット遺伝子編集を用いた治療法も、TTR遺伝子発現の低下を示す有望な初期臨床結果を報告している[8]。
図3：ATTR治療を標的とする多様な革新療法 [8]。
小分子核酸および遺伝子編集療法はいずれもヒト遺伝子を標的とする。たとえば、パチシランはTTR mRNAの3'UTR領域を標的とし、翻訳を阻害することでTTRタンパク質の産生を抑制する。したがって、これらの治療法の前臨床研究において最も効果的なモデルを構築するためには、マウスのTtr遺伝子をヒト遺伝子に置換したヒト化マウスモデルの開発が不可欠である。Cyagenは、マウスTtr遺伝子を完全なヒト遺伝子配列に置換し、病的変異（p.V50M）を導入したモデルを2種類開発した：
- B6-hTTRマウス（製品ID：C001512）：ヒト野生型TTR遺伝子を発現。
- H11-Alb-hTTR*V50Mマウス（製品ID：C001525）：p.V50M病的変異を有するヒトTTR遺伝子を過剰発現。
これらのモデルは、ATTRwtおよびATTRvの治療研究における遺伝子編集、ASO、siRNA療法の開発に必要な基盤を満たす。以下に、次世代のヒト化マウスモデルの詳細を示す。
B6-hTTRマウスはヒトTTR遺伝子およびタンパク質を正常に発現
RT-qPCRおよびELISAによる検出結果から、B6-hTTRマウスはヒト化TTR遺伝子およびタンパク質を正常に発現しており、内因性マウスTtr遺伝子の発現は認められない。
図4：B6-hTTRマウスにおけるヒト化TTR遺伝子およびタンパク質発現の検出
B6-hTTRマウスは小分子核酸薬の有効性評価に用いられる
ブトリシランは、野生型および変異型ヒトTTR mRNAを結合し分解するsiRNA薬であり、2022年に成人の遺伝性ATTR-PN治療に承認された[9]。検証データによると、ブトリシランを単回皮下投与した後、B6-hTTRマウスの血漿中におけるヒトTTRタンパク質の発現レベルは対照群と比較して有意に低下した。
図5：B6-hTTRマウスにおける小分子核酸薬ブトリシランの体内有効性試験
H11-Alb-hTTR*V50Mマウスはヒト変異型TTR遺伝子およびタンパク質を発現
H11-Alb-hTTR*V50Mマウスは、ヒトTTR遺伝子にp.V50M病的変異を導入し、マウスのH11安全ハーバーローカスに挿入することで構築された。このモデルはヒト化TTR遺伝子およびタンパク質を正常に発現しており、体内での発現レベルはB6-hTTRマウスよりもはるかに高い。
図6：H11-Alb-hTTR*V50Mマウスにおけるヒト化TTR遺伝子およびタンパク質発現の検出
まとめ
B6-hTTRマウス（製品ID：C001512）およびH11-Alb-hTTR*V50Mマウス（製品ID：C001525）は、いずれもヒト化TTR遺伝子およびタンパク質を正常に発現している。これらのマウスモデルにおけるTTR mRNAは、ヒトTTRを標的とする小分子核酸薬によって効果的に標的とされ、翻訳発現が抑制され、ヒト化TTRタンパク質の血中レベルが低下する。したがって、これらのマウスモデルはATTRの病態メカニズム研究および標的薬の有効性評価に有効なツールであり、特にターゲット遺伝子編集、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）、小分子干渉RNA（siRNA）など、ヒトTTR遺伝子およびmRNAを標的とする精密治療薬の開発において重要な役割を果たす。
さらに、Cyagenは独自のTurboKnockout融合BAC再結合技術を活用し、B6-hTTRマウスモデルを基盤としたカスタムサービスを提供している。この技術により、異なる病的変異に対応した多様なヒト化点変異疾患モデルの構築が可能となり、TTRのさまざまな病的変異を標的とする精密療法の開発に向けた薬剤スクリーニングおよび薬理学実験のニーズに応えることができる。
参考文献：
[1]Alnylam Pharmaceuticals, Inc. (2024, February 15). Alnylam Pharmaceuticals Reports Fourth Quarter and Full Year 2023 Financial Results and Highlights Recent Period Activity [Press release]. Retrieved from https://investors.alnylam.com/press-release?id=27941
[2]Gillmore JD, Gane E, Taubel J, Kao J, Fontana M, Maitland ML, Seitzer J, O'Connell D, Walsh KR, Wood K, Phillips J, Xu Y, Amaral A, Boyd AP, Cehelsky JE, McKee MD, Schiermeier A, Harari O, Murphy A, Kyratsous CA, Zambrowicz B, Soltys R, Gutstein DE, Leonard J, Sepp-Lorenzino L, Lebwohl D. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. N Engl J Med. 2021 Aug 5;385(6):493-502.
[3]Ibrahim RB, Liu YT, Yeh SY, Tsai JW. Contributions of Animal Models to the Mechanisms and Therapies of Transthyretin Amyloidosis. Front Physiol. 2019 Apr 2;10:338.
[4]Nativi-Nicolau JN, Karam C, Khella S, Maurer MS. Screening for ATTR amyloidosis in the clinic: overlapping disorders, misdiagnosis, and multiorgan awareness. Heart Fail Rev. 2022 May;27(3):785-793.
[5]Koike H, Katsuno M. Transthyretin Amyloidosis: Update on the Clinical Spectrum, Pathogenesis, and Disease-Modifying Therapies. Neurol Ther. 2020 Dec;9(2):317-333.
[6]Merino-Merino AM, Labrador-Gomez J, Sanchez-Corral E, Delgado-Lopez PD, Perez-Rivera JA. Utility of Genetic Testing in Patients with Transthyretin Amyloid Cardiomyopathy: A Brief Review. Biomedicines. 2023 Dec 21;12(1):25.
[7]Aimo A, Castiglione V, Rapezzi C, Franzini M, Panichella G, Vergaro G, Gillmore J, Fontana M, Passino C, Emdin M. RNA-targeting and gene editing therapies for transthyretin amyloidosis. Nat Rev Cardiol. 2022 Oct;19(10):655-667.
[8]Tomasoni D, Bonfioli GB, Aimo A, Adamo M, Canepa M, Inciardi RM, Lombardi CM, Nardi M, Pagnesi M, Riccardi M, Vergaro G, Vizzardi E, Emdin M, Metra M. Treating amyloid transthyretin cardiomyopathy: lessons learned from clinical trials. Front Cardiovasc Med. 2023 May 23;10:1154594.
[9]Keam SJ. Vutrisiran: First Approval. Drugs. 2022 Sep;82(13):1419-1425.
