光を追いかけることを諦めない―遺伝子治療が失明した人々に視力を取り戻す支援を実現
「目は心の窓」といわれるが、先天性の失明を抱える人々は光を見ることができない。世界保健機関（WHO）が公表したデータによれば、世界中で少なくとも22億人が視覚障害または失明を有している。中国は、世界の盲人人口の18～20％を占めており、最も多くの盲人を抱える国である。遺伝性眼疾患は、小児期の失明および視覚障害の約3分の1を占めており、失明および重度視覚障害の80％を占めている。先天性（遺伝性）眼疾患は現在、小児および思春期の失明の最も一般的な原因であり、将来の世代の視力を脅かす最大の要因である。
遺伝性網膜疾患（IRD）は、網膜に影響を及ぼす遺伝的疾患の多様な群であり、光受容体、網膜色素上皮細胞、または脈絡膜の機能不全および変性によって視覚障害を引き起こす。IRDに関連する致病遺伝子は300以上存在する。しかし、現在の研究は主に光受容体型IRDおよび加齢性黄斑変性疾患に注目しており、網膜色素変性症、レーベル先天性アマウローシス、スターガード病などが代表例である。
多くの希少IRDは現在治療法がなく、治療を受けない場合、患者は重度の視覚障害および失明に苦しむ。ほとんどの希少IRDは単遺伝子疾患であり、網膜はアデノウイルス関連ウイルス（AAV）などの遺伝子治療ベクターにとって効率的な標的部位であるため、眼科疾患における標準化された薬物効果評価法の整備が進んでいる。この背景から、AAVを用いた遺伝子治療は、IRDを含む希少眼疾患の患者にとって新たな希望として急速に注目されている。
本稿では、いくつかの希少IRDに対する遺伝子治療アプローチの開発状況を紹介するとともに、前臨床薬効評価に適した信頼性の高い動物モデルの選定を提案する。
網膜・脈絡膜萎縮症（GACR）
網膜・脈絡膜萎縮症（GACR）は、常染色体劣性遺伝性疾患として分類される希少なアミノ酸代謝障害である。線粒体酵素オルニチンアミノトランスフェラーゼ（OAT）をコードする遺伝子の致病的変異によって引き起こされる。OATは主に肝臓で発現しており、GACR患者では血液および体液中のオルニチン濃度が上昇する。進行性の視野狭窄が特徴であり、最終的には失明に至る。初期症状は夜盲症および周辺網膜・脈絡膜の変性による視野狭窄が一般的である。後期には中心視力の著しい低下が認められ、黄斑部に影響が及ぶと完全な失明に至る。現在、根本的な治療法は存在しないが、高濃度のオルニチンが網膜の微細構造に毒性を及ぼす可能性が指摘されており、早期にオルニチン濃度を低下させる介入が病状の予防または遅延に有効である可能性が示唆されている[1-2]。
OAT欠損マウスは新生児期に低オルニチン血症および致死性を示すが、一時的なアルギニン補給により生存が可能となる。離乳後は人間のGACR患者と同様に高オルニチン血症を示す。網膜変性は慢性的に進行し、電気網膜反応（ERG）の振幅が徐々に低下する。時間の経過とともに網膜色素上皮細胞に異常が出現し、光受容体の外側末端が短縮・不整になり、光受容体細胞が進行的に喪失する。OAT欠損マウスは人間のGACRと類似した疾患表現型を示すため、優れた前臨床動物モデルとして利用できる[3-4]。
図1. OAT欠損マウス（Oat-/-）における電気網膜反応（ERG）振幅の顕著な低下[3]
遺伝子治療は多くの単遺伝子疾患に対して有効な治療法として登場している。最近の研究では、肝臓特異的プロモーターを用いたAAV8ベクターによりOAT遺伝子を導入した治療法が検討された。この遺伝子治療ベクター投与後、OAT欠損マウスの血液および網膜中のオルニチン濃度が低下し、ERGの改善が認められ、網膜構造の部分的回復も確認された。これらの効果は少なくとも1年間持続した[5]。本研究は、肝臓標的型AAVを用いた遺伝子治療が高オルニチン血症を効果的に是正し、網膜の機能および構造を改善できることを示し、GACRに対する肝臓標的型AAV遺伝子治療の概念的有効性を証明した。
図2. AAVを用いた肝臓特異的OAT遺伝子治療がOAT欠損マウス（OatΔ）の疾患表現型を改善[5]
ウーシャー症候群型III（USH3）
ウーシャー症候群（遺伝性難聴・網膜色素変性症）は、常染色体劣性遺伝性疾患群であり、網膜色素変性症（RP）と程度の異なる難聴を特徴とする。遺伝的多様性を持つこの疾患群の中で、ウーシャー症候群型III（USH3）は最も希少な形態である。USH3は思春期に進行性の神経難聴と網膜色素変性を特徴とする。CLRN1遺伝子（クラリン-1）がUSH3の発症に唯一関与する遺伝子である。
USH3患者は出生時から聴力に異常がないが、通常、思春期に難聴を発症し、進行的に悪化する。聴力障害と同様に、眼症状も進行性である。視覚症状は通常思春期頃に現れ、多くの患者は夜盲症を初発症状とし、その後視野が徐々に狭まり、トンネル視を呈する。その後、中心視力および色覚が喪失し、最終的には完全な失明に至る[6]。
マウスにおいて、Clrn1遺伝子のノックアウト（KO）は難聴および網膜変性を引き起こす。眼症状として、網膜内の光受容体細胞数の減少が認められ、視覚障害および視野狭窄が生じる。これらの症状はマウスの生後早期に出現し、時間の経過とともに悪化する。また、Clrn1-KOマウスは生後2日目から毛細胞の異常を示し、P21～P25頃に難聴を呈する。
研究者たちは、UTR領域を含むClrn1遺伝子を導入することで、毛包構造の劣化に起因する遅発性進行性難聴をClrn1-KOマウスで再現できた。視覚および聴覚障害に加え、Clrn1-KOマウスは平衡障害や運動協調障害などの他の系統の表現型変化を示すことがある[7-10]。これは人間のUSH3表現型と類似している。
図3. Clrn1ノックアウトマウス（Clrn1-/-）における電気網膜反応（ERG）振幅の障害[8]
同様に単遺伝子疾患であるUSH3に対しても、遺伝子治療アプローチの開発が進められている。ターゲット遺伝子編集を用いたUSH3遺伝子治療に関する複数の研究が報告されている[9-11]。Dinculescuらは、Clrn1-KOマウスを用いてターゲット遺伝子編集による遺伝子治療の体内可行性を検証した。その結果、普遍的・恒常的チキンβ-アクチンプロモーター駆動下で、すべての主要な網膜細胞がターゲット遺伝子編集による遺伝子発現を示した。外因性CLRN1は、内側セグメント領域および外側結合層に局在化し、内因性タンパク質の発現パターンと類似しており、今後のUSH3遺伝子治療研究の設計において重要である。
しかし、全強度のウイルス滴度を網膜下投与した場合、著しい網膜機能の低下が認められ、光受容体細胞におけるCLRN1発現に臨界閾値が存在することが示唆された。これらの知見は、安全なUSH3治療法の開発において、適切なAAVベクター、プロモーター、投与法の選定が極めて重要であることを強調している[11]。
図4. ターゲット遺伝子編集によるCLRN1遺伝子治療がClrn1ノックアウトおよび野生型マウスの網膜タンパク質発現に及ぼす影響[11]
脈絡膜症（CHM）
脈絡膜症（CHM）は、世界で約1/50,000～1/100,000の頻度で発症する希少なX連鎖劣性遺伝疾患である。主な症状は中心視力の進行性低下、視野の狭窄、色覚異常である。CHMはX染色体上に存在するCHM遺伝子の変異によって引き起こされ、男性の方が女性よりも発症頻度が高い。CHM遺伝子は膜骨格タンパク質であるRabエスコートタンパク質-1（REP1）をコードし、網膜色素上皮細胞において重要な役割を果たす。REP1の喪失または機能不全により、網膜色素上皮細胞および網膜の変性が生じ、脈絡膜症が発症する。現在、CHMに対する根本的治療法は存在せず、症状管理に主眼が置かれている[12]。動物研究では、CHM/REP1の全身的または網膜特異的ノックアウト（KO）マウスは、光受容体の進行性変性、Rabの前体化異常、網膜色素上皮細胞の変性、網膜萎縮、網膜血管異常、視覚障害などの眼関連表現型異常を示す[13-14]。
図5. CHM/Rep1の網膜特異的ノックアウトにより光受容体の重度変性が生じる[14]
現在、網膜下投与によるCHM発現AAVベクターを用いた遺伝子治療の臨床試験が少なくとも8件実施されており、BiogenのBIIB111/AAV2-REP1および4D Molecular Therapeuticsの4D-110が代表例である[15]。BIIB111/AAV2-REP1は第3相STAR試験において主要評価項目および主要二次評価項目を達成できなかったが、STAR試験前の臨床および前臨床データは、今後のCHM遺伝子治療アプローチの開発に貴重な参考情報を提供している。これらの研究から得られた知見は、脈絡膜症を含む遺伝性網膜疾患の革新的治療法の構築に貢献している。前臨床研究においては、CHM/Rep1遺伝子ノックアウトマウスは、薬効評価のための不可欠なモデルとして用いられている。ある研究では、AAV2/2-CBA-REP1遺伝子治療がCHM/Rep1遺伝子ノックアウトマウスの暗順応ERGのa波およびb波振幅に用量依存的な効果を示した。高用量のAAV2/2-CBA-REP1投与により、CHM/Rep1遺伝子ノックアウトマウスの暗順応網膜機能が改善された[16]。
図6. CHM/Rep1遺伝子ノックアウトマウスを用いたAAV2/2-CBA-REP1の薬効評価実験[16]
希少疾患研究リソース－遺伝子改変マウスモデル
遺伝子改変マウスモデルは、希少疾患の病態メカニズム解明および前臨床薬物開発・評価において重要な役割を果たす。Cyagenは、OAT、CLRN1、CHMなど、希少疾患に関連する遺伝子ノックアウト（KO）および条件的（例：組織特異的）KO（cKO/floxed）モデルを含む、数千種類の独自開発されたゲノム編集マウス品種を提供している。さらに、カスタム動物モデル（CAM）開発およびCROサービスも、研究ニーズに応じてカスタマイズ可能であり、迅速かつ包括的なCAM/CROソリューションにより、希少疾患研究の加速を支援する。
| 疾患 | 対象遺伝子 | タイプ |
|---|---|---|
| 網膜・脈絡膜萎縮症（GACR） | Oat | KO, CKO |
| ウーシャー症候群型III（USH3） | Clrn1 | KO |
| 脈絡膜症（CHM） | Chm | KO, CKO |
Cyagen眼科疾患CROサービス
総合的な契約研究機関（CRO）サービスプロバイダーとして、Cyagenは眼科疾患を遺伝子治療の突破口と認識し、前臨床研究を支援する眼科遺伝子治療プラットフォームを構築した。経験豊富な専門チームが、小型動物用の最新鋭眼科機器を活用して標準化された評価サービスを提供できる。当社の眼科技術には、Micron IV小型動物網膜顕微鏡画像システム、全領域電気網膜反応（ffERG）、画像誘導型光学干渉断層計（OCT）システム、およびマウス用ハンドヘルド眼圧計が含まれる。糖尿病網膜症、網内層腫瘍、加齢性黄斑変性、新生児網膜症（ROP）、脈絡膜新生血管、網膜色素変性症などの眼関連疾患のラット・マウスモデルに対応した検査サービスを提供している。16年の遺伝子編集モデル構築経験を基盤に、Cyagenは眼科遺伝子治療のための標準化された前臨床研究ソリューションを幅広く提供できる。
HUGO-GT™プログラム
遺伝子治療薬の開発を加速するため、Cyagenは次世代ヒューマナイズドマウスモデル開発プログラム「HUGO-GT™」を開始した。独自開発の全ゲノムDNAヒューマナイズドゲノムオルソログ（HUGO-GTTM）マウスを基盤とし、遺伝子治療法（ASO／ターゲット遺伝子編集／siRNAなど）の効率的スクリーニングに適した致病遺伝子の全ゲノムカバーを実現している。希少先天疾患および遺伝子治療薬開発に向けたより適した全ゲノムヒューマナイズドモデルの創出を可能にした。希少疾患データセンター（RDDC）という、疾患・遺伝子・動物モデル・薬物臨床情報にアクセス可能な包括的生物学データプラットフォームを基盤とし、TurboKnockout技術およびBAC融合技術を駆使して、大規模から完全なゲノム置換・ヒューマナイズド化を実現した。
眼科疾患分野において、Cyagenは独自に全ゲノムヒューマナイズドマウスを構築しており、野生型全ゲノムヒューマナイズドマウス「hRHO」をはじめ、これに基づく眼科疾患モデル（例：hRHO-P23H点突然変異モデル）およびhCEP290など、他の眼科モデルも開発している。
参考文献：
[1] Pauleikhoff L, Weisschuh N, Lentzsch A, Spital G, Krohne TU, Agostini H, Lange CAK. Clinical characteristics of gyrate atrophy compared with a gyrate atrophy-like retinal phenotype. Eur J Ophthalmol. 2023 May 23:11206721231178147.
[2] Elnahry AG, Tripathy K. Gyrate Atrophy of the Choroid and Retina. 2023 Apr 10. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2023 Jan.
[3] Wang T, Milam AH, Steel G, Valle D. A mouse model of gyrate atrophy of the choroid and retina. Early retinal pigment epithelium damage and progressive retinal degeneration. J Clin Invest. 1996 Jun 15;97(12):2753-62.
[4] Wang T, Lawler AM, Steel G, Sipila I, Milam AH, Valle D. Mice lacking ornithine-delta-aminotransferase have paradoxical neonatal hypoornithinaemia and retinal degeneration. Nat Genet. 1995 Oct;11(2):185-90.
[5] Boffa I, Polishchuk E, De Stefano L, Dell'Aquila F, Nusco E, Marrocco E, Audano M, Pedretti S, Caterino M, Bellezza I, Ruoppolo M, Mitro N, Cellini B, Auricchio A, Brunetti-Pierri N. Liver-directed gene therapy for ornithine aminotransferase deficiency. EMBO Mol Med. 2023 Apr 11;15(4):e17033.
[6] Geng R, Omar A, Gopal SR, Chen DH, Stepanyan R, Basch ML, Dinculescu A, Furness DN, Saperstein D, Hauswirth W, Lustig LR, Alagramam KN. Modeling and Preventing Progressive Hearing Loss in Usher Syndrome III. Sci Rep. 2017 Oct 18;7(1):13480.
[7] Johnson KR, Gagnon LH, Webb LS, Peters LL, Hawes NL, Chang B, Zheng QY. Mouse models of USH1C and DFNB18: phenotypic and molecular analyses of two new spontaneous mutations of the Ush1c gene. Hum Mol Genet. 2003 Dec 1;12(23):3075-86.
[8] Tian G, Lee R, Ropelewski P, Imanishi Y. Impairment of Vision in a Mouse Model of Usher Syndrome Type III. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2016 Mar;57(3):866-75.
[9] Geng R, Omar A, Gopal SR, Chen DH, Stepanyan R, Basch ML, Dinculescu A, Furness DN, Saperstein D, Hauswirth W, Lustig LR, Alagramam KN. Modeling and Preventing Progressive Hearing Loss in Usher Syndrome III. Sci Rep. 2017 Oct 18;7(1):13480.
[10] Geng R, Geller SF, Hayashi T, Ray CA, Reh TA, Bermingham-McDonogh O, Jones SM, Wright CG, Melki S, Imanishi Y, Palczewski K, Alagramam KN, Flannery JG. Usher syndrome IIIA gene clarin-1 is essential for hair cell function and associated neural activation. Hum Mol Genet. 2009 Aug 1;18(15):2748-60.
[11] Dinculescu A, Stupay RM, Deng WT, Dyka FM, Min SH, Boye SL, Chiodo VA, Abrahan CE, Zhu P, Li Q, Strettoi E, Novelli E, Nagel-Wolfrum K, Wolfrum U, Smith WC, Hauswirth WW. AAV-Mediated Clarin-1 Expression in the Mouse Retina: Implications for USH3A Gene Therapy. PLoS One. 2016 Feb 16;11(2):e0148874.
[12] Brambati M, Borrelli E, Sacconi R, Bandello F, Querques G. Choroideremia: Update On Clinical Features And Emerging Treatments. Clin Ophthalmol. 2019 Nov 18;13:2225-2231.
[13] Kalatzis V, Roux AF, Meunier I. Molecular Therapy for Choroideremia: Pre-clinical and Clinical Progress to Date. Mol Diagn Ther. 2021 Nov;25(6):661-675.
[14] Tolmachova T, Anders R, Abrink M, Bugeon L, Dallman MJ, Futter CE, Ramalho JS, Tonagel F, Tanimoto N, Seeliger MW, Huxley C, Seabra MC. Independent degeneration of photoreceptors and retinal pigment epithelium in conditional knockout mouse models of choroideremia. J Clin Invest. 2006 Feb;116(2):386-94.
[15] Tolmachova T, Wavre-Shapton ST, Barnard AR, MacLaren RE, Futter CE, Seabra MC. Retinal pigment epithelium defects accelerate photoreceptor degeneration in cell type-specific knockout mouse models of choroideremia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010 Oct;51(10):4913-20.
[16] Cehajic Kapetanovic J, Barnard AR, MacLaren RE. Molecular Therapies for Choroideremia. Genes (Basel). 2019 Sep 23;10(10):738.
