IECがMHC IIおよびPD-L1を用いてT細胞を誘導するメカニズム

1. IELの分化にはIECにおけるMHC IIの発現が必須である

IECがDP IEL分化において特異的な抗原提示細胞（APC）として機能するかを検証するため、C57BL/6野生型マウスの小腸不同部位におけるIECのMHC II発現を解析しました。フローサイトメトリーおよびRNA-seq解析の結果、IECのDP IEL分化における役割はMHC II抗原提示と強く関連していることが示されました。さらに、IECに発現するMHC IIがDP IEL分化に果たす役割を確認するため、IEC特異的MHC IIノックアウトマウス（MHC II△IEC）を用いて、MHC II発現がIECに必須であることを実証しました。MHC II^fl/flコントロールマウスと比較して、DP IELの分化が著しく阻害されたことが確認されました（図1G-H）。

2. IECにおけるMHC IIの発現はIFN-γに依存する

IFN-γは非造血細胞（IECを含む）におけるMHC IIの強力な誘導因子であることが報告されています。この仮説を検証するため、IFN-γ受容体ノックアウトマウス（IFN-γR^−/−）を用いました。その結果、IFN-γR^−/−マウスのIECではMHC IIの発現が検出されず、DP IELの分化は著しく阻害され、SP T細胞中のDPの割合はほぼ0にまで低下しました（図2A）。野生型マウスでは抗IFN-γ抗体の投与により、MHC II発現およびSP IEL中のDP割合が有意に低下しました（図2B）。他の報告でも、IFN-γがDP IELの分化に不可欠であり、転写因子T-betの誘導によってDP IELの機能的成熟を促進することが示されています。すなわち、IFN-γはDP IELの機能成熟において重要な役割を果たしていると考えられます。

IECにおけるMHC II+細胞がDP IEL分化に特異的なAPCとして機能するかを直接検証するため、IFN-γR^+/+マウスおよびIFN-γR^−/−マウス由来の小腸オルガノイドを構築しました。まず、IFN-γがオルガノイド内でもin vivoと同様の効果を発揮することを確認しました。IFN-γはIFN-γR^+/+マウス由来オルガノイドのIECにおけるMHC II発現を強力に誘導しました（図2D-E）。また、他の研究結果では、T細胞に発現するT-betがDP IEL分化の重要な上流調節因子であり、Runx3の発現を誘導しThPOKの発現を抑制することが示されています。腸管微小環境刺激因子を用いた条件下、T-betによって誘導されるIFN-γなどのサイトカインが、DP IEL分化をさらに促進することが明らかになりました。そこで、IFN-γで事前刺激した小腸オルガノイドと、抗CD3ε/CD28で24時間事前刺激したオボアルブミン特異的CD4+ T細胞（OT-II）を、腸管微小環境刺激因子（TGF-βおよびレチノイン酸[RA]）を添加した状態で共培養しました（図2F）。その結果、IFN-γは大量のMHC II発現を誘導し、MHC II+IECがDP IEL分化において特異的なAPCとして機能することが示されました。さらに、TGF-βおよびRAの刺激はDP IEL分化を促進することが確認されました。

3. IFN-γによって誘導されるIEC上のPD-L1はDP IEL分化において重要な役割を果たす

前述の実験結果から、MHC II+IECはCD4+ IELに対する同種刺激としてAPCとして機能すると推測されました。研究者らは、MHC IIと協調する共刺激分子がIEC上に発現している可能性を検討しました。MHC II発現がIFN-γに依存するため、これらの共刺激分子はIECにおけるIFN-γシグナルと関連していると予想されました。小腸オルガノイドをIFN-γ処理有無で比較したRNA-seq解析により、PD-L1をコードするCd274遺伝子の発現がMHC II関連遺伝子と強く相関していることが明らかになりました（図3A-B）。オルガノイド実験（図3C）およびin vivo実験（図3D-E）の結果、IFN-γはPD-L1発現量に顕著な影響を及ぼすことが確認されました。さらに、DP IEL分化にIEC上でのPD-L1発現が必要であるかを検証するため、PD-L1ノックアウトマウス（PD-L1^−/−）、成熟T細胞およびB細胞を持たないRAG-1ノックアウトマウス（RAG-1^−/−）、IEC特異的PD-L1ノックアウトマウス（PD-L1△IEC）、およびCyagenが構築したPD-L1^fl/flコントロールマウスを用いました。これらの実験結果（図F-H）から、IEC上でのPD-L1発現がDP IEL分化に重要な役割を果たしていることが示されました。

図3A-B. 差分発現遺伝子のヒートマップ（A）、ボルカノプロット（B）。

図3C-E. （C）IFN-γ濃度依存的な小腸オルガノイドにおけるPD-L1発現量；（D）IFN-γR^−/−マウスではIFN-γR^+/+マウスと比較してIECにおけるPD-L1発現量が顕著に低下；（E）IFN-γR^+/+マウスに抗IFN-γ抗体を投与すると、IECにおけるPD-L1発現量が顕著に低下した。

図3F-H. （F）PD-L1^+/+マウスと比較して、PD-L1^−/−マウスの回腸におけるDP IELの割合は顕著に低下；（G）RAG-1^−/−マウスに脾臓由来CD4+ T細胞を移植後、抗-PD-1治療によりDP IELの発達が阻害された；（H）PD-L1^fl/flマウスと比較して、PD-L1^△IECマウスの回腸におけるDP IELの割合は顕著に低下した。

4. 腸内微生物叢は小腸におけるMHC IIおよびPD-L1の発現、およびDP IEL分化に不可欠である

小腸におけるIFN-γ産生およびIECにおけるMHC II発現は、微生物叢の存在を必要とするという報告があります。そこで、IECにおけるPD-L1発現が微生物叢によって調節されるかどうかを検証するため、無菌（GF）マウスおよび特定病原体フリー（SPF）マウスを用いて実験を行いました。実験結果から、微生物叢によって誘導されるIFN-γがIECにおけるMHC IIおよびPD-L1の発現を刺激し、これらがDP IEL分化の調節に機能している可能性が示唆されました。

図4A. SPFマウスと比較して、GFマウスの回腸におけるIECのPD-L1発現量は顕著に低下しており、小腸全体におけるMHC II発現量およびDP IELの割合も顕著に低下していた。特に回腸で顕著な変化が認められた。

図4B. 抗生物質投与後、SPFマウスの回腸におけるIECのPD-L1発現量は顕著に低下し、小腸全体におけるMHC II発現量およびDP IELの割合も顕著に低下した。特に回腸で顕著な変化が認められた。

図4C. 免疫蛍光染色の結果、SPFマウスの回腸ではIECの20%がPD-L1を発現していたが、GFマウスではMHC IIおよびPD-L1の発現が顕著に低下していた。

5. PD-1シグナルはThPOK発現の抑制によってDP IELの分化を促進する

一般的なCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞は、それぞれTヘルパー誘導POZ/Krüppel様転写因子（ThPOK）およびラント関連転写因子3（Runx3）を発現することで、自己の線維を維持しています。したがって、DP IELの分化にはRunx3発現の上昇およびThPOKの喪失が必要です。また、IECにおけるMHC IIおよびPD-L1発現がDP IEL分化に重要であることは、TCRおよびPD-1シグナルがCD4+ IELの細胞再プログラミングに参加している可能性を示唆しています。以前の実験結果では、T細胞の内因性PD-1シグナルがDP IEL分化に不可欠であることが示されています（図5A-C）。さらにその分子機構を解明するため、ThPOK-GFPレポーターマウスを用いました。その結果、PD-1シグナルによるThPOK発現の抑制およびDP IEL分化には、PD-1シグナルの存在が必須であることが確認されました（図5D-E）。さらにin vitro実験結果（図5G-I）では、PD-1シグナルが古典的なSrc同様領域含有チロシンリン酸酵素（SHP）経路を介してCD4+ IELにおけるThPOK発現を低下させ、DP IEL分化を促進することが示されました。

図5A-C. （A）C57BL/6野生型マウスにおける異なるIELサブグループにおけるPD-1発現。SP IELがDP IELに分化する過程でPD-1発現は低下した。（B）PD-L1^+/+マウスと比較して、PD-L1^−/−マウスの小腸におけるDP IELの割合は顕著に低下した。（C）PD-L1^+/+およびPD-L1^−/−マウス由来脾臓CD4+ T細胞を1:1で混合し、RAG-1^−/−受容マウスに移植した。PD-L1^−/− CD4+ T細胞由来のDP IELの割合は顕著に低下した。

図5D-F. （D）実験設計。ThPOK-GFPレポーターマウス由来脾臓T細胞をRAG-1^−/−受容マウスに移植し、再構成期間中に抗PD-1抗体投与を行った。（E）ThPOKおよびRunx3発現レベル；（F）DP IELの割合。

図5 G-I. （G）CD4+ T細胞、TGF-β、RA、PD-L1を3日間共培養後、ThPOKhi細胞の割合を測定。PD-L1はThPOK発現の低下を介して調節した。（I-H）CD4+ T細胞、TGF-β、RA、PD-L1およびSHP阻害剤（SHPi）を3日間共培養後、DP IELの割合およびThPOK・Runx3発現レベルを測定。

結論

まとめると、本研究ではIECが腸内DP IEL分化を促進する重要な調節因子であり、特異的なAPCとして機能することを示しました。腸内微生物叢によって産生されるIFN-γは、IECにおけるMHC IIおよびPD-L1の発現を刺激し、SP IELに対してTCR刺激および共刺激シグナルを提供することで、DP IELへの分化を促進します。また、IECの生理的部位特異的な遺伝子発現プロファイルが、周囲の組織在住免疫細胞（例：DP IEL分化）に影響を与える可能性も示されました。

注記：本記事におけるすべてのマウスはC57BL/6系統です。

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参考文献

Moon S , Park Y , Hyeon S , et al. Niche-specific MHC II and PD-L1 regulate CD4+CD8αα+ intraepithelial lymphocyte differentiation[J].
Journal of Experimental Medicine, 2021, 218 (4).DOI: 10.1084/jem.20201665