KO-First: A Tool for Studying Gene Function Across the Mammalian Genome

ノックアウト・ファースト戦略の概要

2000年代初頭から、C57BL/6 マウスES細胞において全転写産物にラベルを付けたノックアウト突然変異の包括的なリソースを構築するため、大規模なノックアウトコンソーシアムが設立されてきました。本稿では、国際マウス表現型コンソーシアム（IMPC）が主導する国際ノックアウトマウスコンソーシアム（IKMC）の一環として実施されている「ノックアウト・ファースト」（KOファースト）条件付きアレル戦略について簡単に紹介します。この戦略は、すべてのプロテオーム解析にラックZ（lacZ）タグを付した条件付きアレルを生成する基盤となっています。IMPCが採用する戦略は、遺伝子機能を阻害する「すべての転写アイソバリアントに共通するクリティカルなエクソン」を特定して削除するというアプローチを中心に据えており、正確なノックアウトアレルの生成を可能にしています¹。ここでは、KOファーストアレル設計が持つ機能ゲノミクスおよびプロテオミクス解明への貢献、ならびにIMPCプログラムの一環としてすべての蛋白質コード遺伝子にラックZタグを付したノックアウト突然変異を網羅的に生成する上での利点について述べます。

蛋白質コード遺伝子の機能解析

ヒトおよびネズミの完全なゲノム配列解読は、研究への知見をもたらすだけでなく、遺伝子機能の理解に関してさらに多くの疑問を提起しました。未だに蛋白質コード遺伝子の完全な機能解析は、遺伝学者にとって重要な目標かつ技術的課題です。この課題に取り組む初期のアプローチとして、マウス胚性幹（ES）細胞を用いたゲノムワイドな突然変異導入や、ジェントラップ戦略が挙げられます。ジェントラップ法はマウスの蛋白質コード遺伝子の半数以上にランダムな挿入突然変異を導入しましたが、この手法には遺伝子トラップアレルを正確に設計できないという限界があり、完全なノックアウト遺伝子セットの生成には不向きです。IMPCは数年にわたり標的型遺伝子編集技術を用いてノックアウト遺伝子を生成してきましたが、ノックオフターゲット効果への懸念が高まるにつれ、ツールの正確性を検証するための包括的な遺伝子配列解析が不可欠となっています。

胚性幹（ES）細胞を用いた遺伝子ターゲティングは、正確さと汎用性から、今なお遺伝子改変動物モデルを作成するための主要な技術です。ES細胞を用いた遺伝子ターゲティングは、標的遺伝子を保持しつつ、ノックアウトおよび条件付き応用の両方に使用可能なマルチパーパスアレルを生成するための「KOファースト」戦略の確立にも寄与しました。

ノックアウト・ファースト条件付きアレル戦略の利点

KOファースト戦略は、マウス、ラット、ヒト多能性幹細胞を含む多くのモデルシステムにおいて、機能ゲノミクスおよびプロテオミクスにわたる包括的なインパクトを持っています。この戦略は、プロteオームマッピングのための体系的でゲノムスケールのプログラムを可能にする機能ゲノミクスプラットフォームとして機能します。条件付きアレル、すなわちKOファーストアレルを用いることで、開発過程における組織特異的または時間的制御のもとでの遺伝子機能の解析が可能になります。KOファーストアレルは、構成的に発現される突然変異の持つ制限を克服し、部位特異的サイクリーゼーション組換え酵素（Cre）およびフリッパーゼ（FLP）組換え酵素への曝露によって、レポーターノックアウト、条件付きノックアウト、ノアレルを柔軟に生成できます。これは、FLPおよびcre マウスとの交配によって実現します。さらに、cKOアレルはES細胞において二重組換えメディエート・カセット交換を用いて容易に改変できます。遺伝子ターゲティング技術の進展により、cKOアレルは「条件付き突然変異を用いた包括的な機能研究のための二重ターゲットES細胞株を体系的に生成する」ことを支援しており、これはRNA干渉研究を補完し、完全な遺伝的ノックアウトを提供することでその意義を持ちます。研究ごとに適切なcre マウスと交配することで、遺伝子の時空間的発現を制御でき、必要に応じて全身ノックアウトを実現可能です。ヘテロ接合致死表現型を示す遺伝子を対象とする研究では、FRTで挟まれたストップカセットを除去できる点が特に有用です³。

KOファーストアレルの汎用性

EUCOMMおよびKOMP-CSDにおけるKOファーストアレル構築には、プロモーター駆動型およびプロモアラス型のターゲティングカセットが使用されています。これはIKMC活動の一環です。初期の改変を受けていないノアレル（tm1a）は、「遺伝子のイントロンにラックZトラップカセットと、floxedプロモーター駆動型neoカセットを挿入する」ことで得られます¹。FRTサイト間に存在するジェントラップカセットをFLP組換え酵素によって除去すると、突然変異は野生型にリバートし、遺伝子活性が回復します。この結果、条件付きアレル（tm1c）ではクリティカルエクソンの両側にloxPサイトが残ります。この条件付きアレル（tm1c）をCreに曝露すると、クリティカルエクソンが削除され、フレームシフト突然変異（tm1dアレル）が生じ、変異型転写産物のノンセンスメディエーテッド・デカップ（NMD）が誘導され、ノアレルの回復が可能になります。上述の通り、この戦略により、FLPで表現型をリバートでき、Creで表現型を誘導できるため、培養ES細胞内で発生した二次的な連鎖突然変異の評価が可能になります。また、KOファースト（tm1a）アレルを持つマウスは、適切なCreドライバー系統と交配することで、選択カセットを除去し、遺伝子内の重要なエクソンを欠失させることで、IMPCによる表現型解析用のラックZタグ付きノアレル（tm1b）を生成できます。以下に、KOファースト戦略で得られるアレルの概要を示します。

図1：ノックアウト・ファースト条件付きアレル戦略の模式図

過去4年間だけで、Cyagenの専門家はNfe2l1、Tob1、Mir28a、Ccdc13、Tmem138、Mettl3など、さまざまな遺伝子に対して16のKOファーストマウスモデル系統を研究者に提供してきました。

利用事例 - Cyagen提供Ep300ノックアウト・ファーストモデル：

Zhou, P., Gu, F., Zhang, L., Akerberg, B. N., Ma, Q., Li, K., … Pu, W. T. (2017). Mapping cell type-specific transcriptional enhancers using high affinity, lineage-specific Ep300 bioChIP-seq. ELife, 6. doi: 10.7554/elife.22039

ご関心のある遺伝子の研究にKOファースト戦略をご検討の場合は、お問い合わせください。48時間以内に、遺伝子改変の専門家が無料のプロジェクト戦略および見積もりをご提供いたします。

参考文献

• Allele design - IMPC: International Mouse Phenotyping Consortium. (0AD). 2019年9月26日取得: https://www.mousephenotype.org/understand/the-data/allele-design/
• KOMP Allele Types. (0AD). 取得元: https://www.komp.org/alleles.php
• Skarnes, W. C., Rosen, B., West, A. P., Koutsourakis, M., Bushell, W., Iyer, V., … Bradley, A. (2011). A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature, 474(7351), 337–342. doi: 10.1038/nature10163