NLRP3インフラマソームの研究に向けたマウスモデルの活用

NLRP3遺伝子概要

NLRP3遺伝子は、ピリン様タンパク質であるNLRファミリー・ピリンドメイン含有3をコードし、ピリンドメイン、ヌクレオチド結合部位（NBSドメイン）、ルシントモチーフを有するルシン豊富反復配列を含みます。このタンパク質は、アポトーシス関連タンパク質であるPYCARD/ASCと相互作用し、PYCARD/ASCはカスパーゼ活性化ドメインを有しており、NLRP3インフラマゾーム複合体に属します。この複合体は、NF-κBシグナル伝達の上流調節因子として、炎症、免疫反応、アポトーシスの調節に関与します。特にNLRP3遺伝子は、NLRP3インフラマゾーム複合体の受容体機能を果たすセンサー構成要素をコードしています。

IL-1βは、別の炎症性インターロイキンであり、その生成は少なくとも3段階で厳密に調節されています。第1段階はpro-IL-1βタンパク質（p35）の生成であり、第2段階は非活性なpro-IL-1β前駆体が活性化されたIL-1βタンパク質（p17）に切断される過程であり、第3段階はIL-1βが細胞外へ分泌されるものです。この過程の途中段階であるpro-IL-1βの加工段階では、カスパーゼ-1活性化複合体が働きます。その中で最も代表的なものがインフラマゾームです。NLRP3インフラマゾームは、非活性なpro-caspase-1を活性化されたカスパーゼ-1に変換し、pro-IL-1βを成熟したIL-1βに切断することで、炎症反応および早期細胞死を誘導します。

NLRP3遺伝子の優性突然変異（Cryopyrin）は、家族性冷誘発自己炎症症候群（FCAS1）、Muckle-Wells症候群（MWS）、慢性小児期神経皮膚関節症候群（CINCA）を含む一連の炎症性疾患と関連していることが明らかになっています。

自己炎症症候群（Familial Cold Autoinflammatory Syndrome）

自己炎症症候群（FCAS）は、まれな遺伝性炎症疾患であり、冷刺激にさらされた際に発疹、発熱、関節痛などの全身性炎症症状が反復して現れます。FCASは乳児期または小児初期に発症し、患者の生涯にわたって持続します。一般的には常染色体優性遺伝様式で現れ、NLRP3遺伝子によりコードされるCryopyrinタンパク質を含むタンパク質複合体の活性上昇を引き起こすヘテロ接合突然変異によって引き起こされます。これらの突然変異は、Cryopyrinを含むインフラマゾーム複合体の活性を増加させ、炎症調節に関与するインターロイキン-1β（IL-1β）タンパク質の分泌増加を引き起こし、これが発熱および関節痛などの炎症症状を誘導します。

FCASは近年発見された疾患であり、実際の発症率および有病率を把握することが困難です。CINCAおよびMWSの症状はFCASと類似しており、明確な表現型の重複が存在します。家族性冷誘発自己炎症症候群1（FCAS1）は、1番染色体長腕（q44）に位置するNLRP3遺伝子のヘテロ接合突然変異によって引き起こされ、FCAS2は19番染色体q13に位置するNLRP12遺伝子の突然変異によって、FCAS3は16番染色体q23に位置するPLCG2遺伝子の突然変異、FCAS4は2番染色体p22に位置するNLRC4遺伝子の突然変異によって発生します。

Nlrp3遺伝子変異マウス表現型

1. 点突然変異モデル

アラニン352がバリンに置換されたA352V突然変異と、ルシン353がプロリンに置換されたL353P突然変異は、それぞれ典型的なMWSおよびFCAS患者と密接に関連していますが、重複表現型患者との関連性は低いです。これらの2つの突然変異マウスモデルが作成されました：Nlrp3 A350VおよびNlrp3 L351P。イントロン内にNeo遺伝子が存在するため、遺伝子の正常発現が抑制されており、さまざまなプロモーターによって制御されるクレ再組織酵素を発現するマウスと交配することで、Neoが除去され、突然変異遺伝子が特定組織で発現するようにしています。

Nlrp3 A350V/+ / CreZ（妊娠中にNeoを除去し、突然変異遺伝子を発現させるモデル）の新生マウスは、生後1～2日以内またはその前から炎症表現型を示し、4日目には膿瘍および角質性紅斑症状を示しました。また、このマウスは4日目に顕著な成長遅延、色素欠損、毛髪減少を示しました。Nlrp3 A350V/+ / CreL（骨髄細胞でNeoを除去し、突然変異遺伝子を発現させるモデル）の新生マウスも類似の表現型を示しましたが、生存率の差があり、70％のマウスが7～9日まで生存しましたが、その後急速に死亡しました。

図4. Nlrp3点突然変異マウスの表現型データ [3]

MWS患者で観察される蕁麻疹様病変とは異なり、A350V発現新生マウスでは皮膚紅斑、膿瘍、角質産生などの炎症反応が認められました。突然変異マウスの白血球数はわずかに増加しましたが、好中球および血小板の増加は顕著でした。CAPS患者でも同様の血液学的および皮膚所見が報告されています。Nlrp3 A350V/+ / CreL新生マウスの炎症性皮膚生検について、IL-1βおよびIL-6の免疫組織化学的分析を行った結果、両インターロイキン（IL-1βは真皮層、IL-6は表皮層）の発現増加が観察され、CAPS患者の皮膚生検結果と類似した傾向を示しました。TNFαは有意差を示さず、これは従来のCAPS患者と同様の傾向を示しています。

図5. Nlrp3点突然変異マウスの血清および皮膚内サイトカイン発現増加 [3]

2. ノックアウトマウスモデル

ES細胞標的化技術を用いて、Nlrp3（Cias1）ノックアウトマウスモデルを構築しました。ATG開始位置にEGFPを挿入することで、遺伝子発現を抑制しました：

図6. Nlrp3ノックアウトマウスの標的化戦略 [5]

遺伝子型が正常なマウス（Wild-type）、Nlrp3 +/-、Nlrp3 -/-マウスのマクロファージは、pro-IL-1βを相当量生成しますが、ATP処理後、Nlrp3 -/-マクロファージはpro-IL-1βを切断できませんでした。これはCryopyrinがATP誘導カスパーゼ-1活性化に不可欠であることを示しています。LPSまたはPam3CSK4で刺激された正常マクロファージは、ネカチンまたはミトトキシンに対してIL-1βおよびIL-18を分泌しますが、Asc -/-およびNlrp3 -/-マクロファージは、IL-1βまたはIL-18を有意なレベルで分泌できませんでした。

CAPS治療

大多数のCAPS患者は、NLRP3遺伝子の突然変異によって引き起こされ、これにより生成される突然変異タンパク質であるCryopyrinがインフラマゾームを活性化し、IL-1βの過剰生成に至ります。IL-1βはCAPSの炎症症状を引き起こし、IL-1阻害剤は安全かつ効果的な治療オプションです。IL-1阻害剤の登場により、この重篤な疾患に対する治療が可能になりました。

非ステロイド性抗炎症薬は関節痛の緩和に使用され、高用量コルチコステロイドもある程度効果を示しますが、短期的・長期的な副作用が生じる可能性があります。

Regeneron PharmaceuticalsのArcalyst（Rilonacept）は、IL-1遮断剤であり、2008年にFDA承認を受け、12歳以上の成人および小児におけるFCASおよびMWSを含むCAPS治療に使用されています。

NovartisのIlaris（Canakinumab）は、IL-1βを標的とした単クローン抗体であり、2009年にFDA承認を取得し、成人および小児のCAPS患者の治療に使用されています。FCASおよびMWSを含む。

Biovitrum PharmaceuticalsのKineret（Anakinra）は、IL-1受容体拮抗剤であり、FCAS患者に対して優れた臨床的効果を示していますが、現在のところFDAからFCASや他のCAPS疾患治療に対する承認を受けていません。

要約

今後の研究は、Cryopyrinの活性化突然変異がインフラマゾームの正常な調節を回避し、家族性冷誘発自己炎症症候群、Muckle-Wells症候群、慢性小児期神経皮膚関節症候群（CINCA）などの炎症疾患をどのように誘導するかを解明することを目指すべきです。注目すべきは、低レベルの細菌感染や異常なタンパク質反応がこれらの疾患の症状を誘発する可能性があるということです。

参考文献

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