RAB7はエンドソームシグナルを制御し、NF-kBの活性化に寄与

RAB7Aタンパク質コード遺伝子概要

ヒトのRAB7A（従来はRAB7として知られていた）遺伝子は、Ras様タンパク質Rab-7a（RAB7A）をコードしており、これはRabタンパク質系統および小Gタンパク質Rasスーパーファミリーのメンバーです。小Gタンパク質または小GTPアーゼとは、グアノシン三リン酸（GTP）を結合した状態で加水分解することができる酵素群を指します。

RAB系統のタンパク質は、膜輸送およびベシクル輸送のさまざまな段階を調節する膜関連タンパク質群です。各RABタンパク質は、細胞内における多様な受容体経路においてタンパク質移動に影響を与える複数のタンパク質群を標的とします。RAB7aタンパク質は、遅延エンドソームのベシクル移動およびライソソームへの移動を調節します。RAB7Aの高い保存性を持つアミノ酸残基の突然変異は、Charcot-Marie-Tooth（CMT）症候群第2型の一部の形態を引き起こすことがあります。RAB7Aの重要な類縁遺伝子として、RAB9Bが挙げられます。¹

RAB7A遺伝子詳細情報

関連疾患：Charcot-Marie-Tooth神経障害、軸索型、2BおよびCharcot-Marie-Tooth病

関連経路：RAB GEFsがRABsに対してGDPの代わりにGTPを交換する経路およびTBC/RABGAPs。代表的な事例研究により、RAB7がB細胞NF-kB活性化複合体の核心構成要素であることが証明された。

一般的な遺伝子略語：

• RAB7A、RASオノコゲノム系統
• RAB7、RASオノコゲノム系統
• Ras様タンパク質Rab-7a
• Charcot-Marie-Tooth神経障害2B
• Ras関連タンパク質RAB7
• PRO2706
• CMT2B

Rab7 B-Tg条件型マウスモデル開発

Rab7 B-Tg（Cd19^+/creRosa26^{+/fl-STOP-fl-Rab7}）マウスモデルは、エンドソームにおけるRAB7がB細胞分化過程においてNF-kB活性化に果たす役割を理解するために開発されました。このモデルの設計には、複数の要素が反映されており、主な内容は以下の通りです。複数の免疫細胞において標的受容体（例：CD40またはTLR4）が結合して内因化（internalize）される可能性を考慮すると、一部の受容体はRAB7を含むエンドソームへ移行し、その受容体のシグナル伝達が行われることがあります。また、研究者らはRAB7の発現または活動が阻害された場合、脂質ラフト依存経路がRAB7依存経路を補完し、NF-kB活性化に寄与する可能性を仮定しました。したがって、研究者らは以下の2つの補完的戦略を通じて、RAB7依存経路の機序的基盤を解明することを目指しました：

1. RAB7発現の増強（すなわち、B細胞特異的RAB7過剰発現マウスの作製）
2. 脂質ラフト依存経路の阻害 – 正常マウスB細胞およびRAB7活動が低下したB細胞の両方で実施

本研究では、分子生物学、細胞生物学、イメージング、インシリコドッキングを含む多様なアプローチを用いて、受容体の内因化、RAB7およびTRAF6との共局在、単一細胞内におけるNF-kB活性化、および活性化誘導サイチジン脱アミノ化酵素（AID）およびクラススイッチDNA再結合（CSR）の発現を解析しました。この2つの戦略により、B細胞分化過程においてTRAF6のK63多ユビキチン化およびNF-kB活性化を促進するRAB7依存的「細胞内膜シグナル複合体」の重要な役割を実証しました。

マウスモデル設計および作製プロセス

Rab7 B-Tg条件型（フロックス化）遺伝子ノックインマウスモデルは、Rosa26遺伝子座でタグのないRAB7を発現するように設計されており、これは元のRab7遺伝子座に近接した位置にあります（図1参照）。この遺伝子工学および飼育アプローチにより、CD19+ B細胞においてRab7転写レベルが上昇し、RAB7の過剰発現が実現されました。注目すべきは、Rab7 B-TgマウスにおいてB細胞の発達、成熟、生存がすべて正常に維持されている点です。

Rab7 B-Tgマウスモデルは以下の方法により作製され、詳細は該当論文に記載されています（強調は原文）。

「Rab7 B-Tgマウスおよびその正常型兄弟マウスは、Cd19^+/creマウス（ジャクソン実験室、登録番号006785）とRosa26^{+/fl-STOP-fl-Rab7}マウスを交配することで作製しました。Rosa26^{+/fl-STOP-fl-Rab7}マウスは、カスタム型TurboKnockoutアプローチ（Cyagen Biosciences）を用いて作製されました。簡単に言えば、ターゲティングベクターはRosa26遺伝子座の第1および第2エクソンに異なる動員配列を有しています。これらの配列の間に、CMVプロモーターを基盤とするRab7 cDNAが配置されていますが、その前にloxP配列を含む『ストップカセット』が配置されており、その後にはNeor遺伝子（黄色蛍光タンパク質）が逆方向に配置されています（参照：図1A）。ターゲティングベクターはC57マウスの胚性幹細胞に導入され、Southern blottingによりターゲティングが正しく行われたクローンが選抜された後、ブリストーシスにマイクロインジェクションされ、キメラマウスが生産されました。その後、これらのキメラマウスをFlippase発現マウスと交配し、生殖能力を確認した上で、Neorを除去した後、C57系統の創始マウスをわずか6か月で生産しました。合計5匹の創始マウス（雌1匹、雄4匹）のうち、2匹（雌1匹、雄1匹）がCd19^+/creマウスと交配され、独立した系統を形成するようにしました。2系統間で測定されたパラメータの差は認められなかったため、本研究では1系統のデータのみを提示しました。Rab7 B-Tgマウスにおいて、Cd19Cre遺伝子座のCd19プロモーターにより制御されるCre再結合により、Rosa26遺伝子座の『ストップカセット』が除去され、CMVプロモーターを基盤とするタグのないRAB7の発現が可能になりました。

推奨引用文 – 研究結果レビュー

参考文献の研究では、Rab7 B-Tgマウスを用いて、マウスB細胞の成熟エンドソームにおいてRAB7小GTPアーゼと結合した免疫受容体（CD40など）が共局在する状態でNF-kB活性化が促進されることを証明しました。RAB7は成熟エンドソームにおいてTRAF6 E3ユビキチンリガーゼと直接結合し、NF-kB活性化に必要なK63多ユビキチン化を促進します。したがって、Rab7 B-TgマウスB細胞におけるRAB7過剰発現は、TRAF6のK63ユビキチン化活性を増加させ、NF-kB活性化および活性化誘導サイチジン脱アミノ化酵素発現を促進し、IgG抗体および自己抗体濃度を上昇させました。総合的に、研究結果は「RAB7がTRAF6との相互作用を通じてB細胞NF-kB活性化複合体の核心構成要素である」と結論づけました。

提示された発見要約

参考文献の研究では、多様な実験的手法が用いられました。これには、フローサイトメトリー、細胞内染色、顕微鏡画像解析、免疫蛍光顕微鏡、細胞膜分画分析、免疫ブロッティングおよび共免疫沈降、生体蛍光複合体解析、リアルタイム定量RT-PCRによる転写産物解析が含まれます。研究者らはこれらの実験データに基づき、以下の結果を導き出しました：

1. B細胞特異的RAB7過剰発現は、抗体反応を向上させる。
2. RAB7過剰発現は、生体および生体外においてクラススイッチDNA再結合（CSR）を増加させる。
3. RAB7はNF-kB活性化を促進し、TRAF6と相互作用してTRAF6活性を増大させる。
4. RAB7はTRAF6と結合し、TRAF6活性を増大させる。
5. CD40は結合時に細胞質へ移行し、活性化されたB細胞内においてRAB7と共局在する。
6. 脂質ラフト阻害とRAB7活性阻害は、NF-kB活性化を遮断する上で相互作用する。

議論および今後の研究：

今後の研究では、TRAF6–RAB7相互作用がNF-kB活性化に与える影響を明らかにするために、相互作用インターフェースに突然変異を導入したモデルを使用できるでしょう。このような活動を阻害する突然変異がCSRの抑制を引き起こすかどうかを検証するのに有効です。RAB7依存細胞膜シグナル複合体の実際の動態を解明するためには、B細胞刺激期間（例：24～48時間）が長期間にわたるため、従来の研究ではその形成速度を正確に捉えきれなかった可能性があります。

NF-kBの過剰活性化は多様な疾患の原因となる一方で、NF-kBは恒常性維持に核心的な役割を果たしているため、薬物ターゲットとしては不適切です。しかし、RAB7はNF-kBの過剰活性化に関連する多様な疾患において共通的な原因遺伝子である可能性があるため、治療ターゲットとしての可能性は非常に高いです。RAB7依存細胞膜シグナル複合体を妨害すれば、プラズマ膜シグナル複合体は基礎的なNF-kB活性を維持しつつ、必須機能を果たすことができます。そのためには、RAB7-TRAF6相互作用を阻害する方法を用いることができ、これはインターフェース突然変異モデルを用いて検証可能です。

参考文献

1. https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=RAB7A
2. Hui Yan, Maria Fernandez, Jingwei Wang, Shuai Wu, Rui Wang, Zheng Lou, Justin B. Moroney, Carlos E. Rivera, Julia R. Taylor, Huoqun Gan, Hong Zan, Dmytro Kolvaskyy, Dongfang Liu, Paolo Casali, Zhenming Xu The Journal of Immunology January 13, 2020, ji1901170; DOI: 10.4049/jimmunol.1901170
3. https://www.jax.org/strain/035443