大規模断片導入型マウスモデルにおけるRMCE

サイト特異的再結合と関連するゲノム改変戦略

サイト特異的再結合酵素（SSR）を用いた遺伝子再結合は、部分的な相同性を持つDNA配列間でDNAを交換するもので、目的遺伝子の導入を標的的に実現します。SSRは通常30〜200塩基対の長さを有する再結合部位においてDNAを再結合させます。再結合は、SSRが再結合部位（部分的逆反復構造を持つ2つのモチーフから成る）に結合した際に発生します。これらの部位の相対的な配置および分子的位置によって、遺伝子の逆位、切除、挿入といった再結合イベントの種類が決定されます。特に、挿入には二本の異なるDNA分子上に存在する再結合部位間での分子間再結合（1本のDNA分子が環状である必要がある）が必要です。

SSRを用いた戦略の例：

• Cre-loxシステム（別名：遺伝子フロキシング）－遺伝子発現の時空間的制御
• 再結合酵素を用いたキャッセトル交換（RMCE）－最大300 kbまでの遺伝子配列の挿入；比較研究用に多数の変異モデルの構築

再結合酵素を用いたキャッセトル交換（RMCE）の応用

再結合酵素を用いたキャッセトル交換（RMCE）は、サイト特異的再結合を活用して、高等真核生物ゲノムにおける体系的かつ繰り返し可能な改変を実現します。RMCEアプローチは、全遺伝子置換および大断片ノックインマウスモデルプロジェクトに適しており、条件的ノックアウト、レポーター、トランスジェニック、ヒューマナイズドマウスモデルの開発に広く用いられています。

RMCE技術では、既存の遺伝子キャッセトル（遺伝子と再結合部位を含む）と、目的遺伝子（GOI）を含む類似のキャッセトルとの交換によって、目的遺伝子を統合します。このため、野生型遺伝子は2つの特異的認識部位で挟まれており、変異したGOIを含むDNAプラスミドも同様の2つの認識部位で挟まれます。再結合酵素（例：Cre）を用いることで、野生型遺伝子と変異GOIを交換します。

大断片ノックインモデル－ヒューマナイズド、トランスジェニック、レポーター、条件的ノックアウト

再結合酵素を用いたキャッセトル交換（RMCE）は、大規模な遺伝子断片の挿入に非常に有効なツールであり、条件的ノックアウト、レポーター、トランスジェニックマウスモデルの効率的構築に利用できます。RMCEは目的遺伝子（GOI）の高効率な導入を可能にし、ヒューマナイズドマウスモデルの構築にも容易に適応できます。人間の発現パターンをマウスで再現することが可能です。弊社のプロジェクト戦略により、BAC融合と3回の標的化を組み合わせたRMCE技術を用いて、最大300 kbの領域まで大断片ノックイン（LFKI）によるヒューマナイズド化および遺伝子改変を実現しています！

比較解析用変異モデルの開発

さらに、再結合酵素を用いたキャッセトル交換（RMCE）技術は、多数の変異モデルを大規模な変異スクリーニング、ドメイン特異的タンパク質機能の解明、および他の比較研究に活用できます。RMCEにより、親株の胚性幹細胞（ES）クローンに直接変異を導入でき、異なる標的ベクターと併用することで、追加の変異細胞およびマウス系統を迅速に生成可能です。親株ESクローンは1系統のみで十分であり、これにより複数の独自の変異細胞ラインおよびその後の変異マウスラインを効率的に構築できるため、時間とコストの削減が可能です。RMCEは、点突然変異、大規模な遺伝子変異、さらには野生型遺伝子を異なるGOIに置換するなど、大規模ゲノム研究において高効率かつコスト効果の高い方法を提供します。

大断片ノックインマウスモデル

Cyagenは、TurboKnockout^™またはターゲット遺伝子編集技術を用いて、エンドジェノム遺伝子座およびRosa26座において、大断片ノックインマウスモデルの構築に成功しています。弊社では、エンジニアリングされた親株ES細胞ラインの作成から、研究用に即座に利用可能なカスタムマウスモデルの提供まで、包括的なサービスを提供しています。

弊社チームが実施した数千件のノックインマウスモデルプロジェクトのデータを基に、弊社の遺伝子編集技術が大規模なゲノム領域の改変においてどこまで限界を押し広げているかについて、新たな知見を蓄積しました。以下に、弊社の遺伝子編集技術における大断片ノックイン（LFKI）の実績を概説します。