AIとミニジェン解析を活用したRNAスプライシング研究の新たなアプローチ
別訳スプライシングは、メッセンジャーRNA前駆体（pre-mRNA）内の異なるスプライシングサイトの組み合わせを選択する調節プロセスであり、これにより同一遺伝子から複数の変異型mRNAが生成される。これらのmRNAは、アミノ酸配列や機能が異なるタンパク質をコードすることができる。
別訳スプライシングの調節には、多数の相互作用する因子が関与しており、スプライソソームタンパク質遺伝子内のcis-作用性配列（cis-acting elements）が影響を与える。わずかな変化（例：1塩基の突然変異）が、Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）や脊髄性筋萎縮症（SMA）などの疾患の発症に関連する異常な別訳スプライシングを引き起こすことがある。
本稿では、臨床サンプル検査の過程において、別訳スプライシングに関連する可能性のある突然変異部位を検証する方法についてご紹介します。科学的検証を行う前に、迅速かつ正確に別訳スプライシングの病的部位をスクリーニングする最適な手法を紹介します。
1. 異常な別訳スプライシングが生じる理由は？
別訳スプライシングは、スプライシングを調節するタンパク質と、イントロンおよびエクソンに存在するcis-作用性配列との相互作用によって生じる。これには、イントロンスプライシング増強子（ISE）、イントロンスプライシング抑制子（ISS）、エクソンスプライシング増強子（ESE）、エクソンスプライシング抑制子（ESS）、およびAg-exon-GT保存配列が含まれる。これらのcis-作用性配列と対応するタンパク質の組み合わせが、エクソンスプライシングの正確性と効率を制御する。また、スプライシング調節タンパク質の発現には、発生段階や組織特異性が見られ、同一タンパク質の発現パターンが異なる時期や組織で変化することがあり、これにより異なるスプライシング型が生成される可能性がある。
これらのcis-作用性配列の配列が突然変異を起こすと、すなわち点突然変異が生じると、さまざまな異常スプライシングが発生する。代表的な異常スプライシングのタイプには、エクソンの完全または部分的欠失、イントロンの完全または部分的保持、複数エクソンの欠失などがある。異常スプライシングの結果として、エクソンの一部が欠失し、アミノ酸の長距離欠損を伴うタンパク質が生成される。また、3の倍数でない挿入や欠失が生じると、フレームシフト突然変異や早期終止コドンの生成が起こり、最終的に正常なタンパク質機能の喪失に至る。
2. 別訳スプライシングはどのように検証されるか？
シーケンシングにより、多数のSNP突然変異部位を取得できる。これらの部位の一部は遺伝子の非翻訳領域（イントロン、プロモーター、インターレジオン間領域など）に位置し、またエクソン・イントロン接合部に近接する部位も存在する。これらの部位はバイオインフォマティクス解析の対象とされ、別訳スプライシングに関連する可能性のある突然変異部位をスクリーニングすることができる。
従来のバイオインフォマティクス予測ツールは、古典的なスプライシングモデルに基づいてスクリーニングを行うが、別訳スプライシングのメカニズムはより複雑である。そのため、従来のアルゴリズムは実際のスプライシング状況を正確に再現できず、多くの病的部位が見逃されてしまう。
従来のバイオインフォマティクス解析とAIモデルを統合することで、検証実験に進む前に関心部位を効率的にスクリーニングできる。RDDC RNAスプライシングツールは、深層ニューラルネットワーク（DNN）戦略とバイオインフォマティクスを組み合わせ、タンパク質翻訳に大きな影響を与えるスプライシング異常を分析し、遺伝性疾患の原因を塩基レベルで特定することを目的としている。RNAスプライシングツールを使用する際は、対象遺伝子、トランスクリプトID、突然変異部位の位置、突然変異の種類を入力するだけで、予測結果を取得できる。
仮説を検証する一般的な方法は、点突然変異細胞株を構築し、細胞表型解析およびcDNA検出を行うことである。しかし、突然変異部位が多数存在する場合、点突然変異細胞株の構築は時間と費用を要する。この場合、効果的なミニゲンシステムを活用することで、検証成功率を大幅に向上させることができる。
ミニゲンスプライシングアッセイは、変異型または野生型部位を含むエクソンおよびその周辺イントロンを体外でベクターにクローン化し、細胞にトランスフェクションした後、RT-PCRおよびシークエンシングによりスプライシング状態を解析する。一般的なメカニズムとして、解析対象のエクソンとその周辺イントロンをクローン化部位に挿入し、ベクター内にはクローン化部位の上流および下流にエクソンAおよびエクソンBが配置される。RT-PCRの増幅プライマーはエクソンAおよびエクソンBの配列に基づいて設計され、後続の検出に用いられる。構築したベクターを細胞にトランスフェクションした結果、野生型群ではエクソンA＋外来エクソン＋エクソンBを含むmRNAが発現する。このゲノタイプはRT-PCRおよびシークエンシングにより確認される。変異型群で野生型と異なるmRNAが発現する場合、異常な別訳スプライシングが生じていると判断できる。
ミニゲンは、異常スプライシングの研究に広く用いられている。家族性解析およびシークエンシング（図2）により、EYS遺伝子に網膜変性と関連する可能性のある突然変異部位が同定された。バイオインフォマティクス解析の結果、2つの突然変異部位が別訳スプライシングに影響を及ぼす可能性があると判明した：c.3877 + 1g > Aおよびc.2992_2992+6delinsTG。
次に、研究者たちはミニゲンシステムを用いて予測結果を検証した。1つ目の部位c.3877 + 1g > Aについては、イントロン24、エクソン25、イントロン25をpspl3ベクターにクローン化し、ARPE-19細胞にトランスフェクションした結果、RT-PCR増幅およびシークエンシングにより異常な別訳スプライシングが確認された（図3）。
2つ目の部位についても同様の方法で検証された：イントロン18、エクソン19、イントロン19をpSPL3ベクターにクローン化し、HEK293TおよびARPE-19細胞にそれぞれトランスフェクションした。RT-PCR増幅およびシークエンシングの結果、この部位でも異常な別訳スプライシングが確認された（図3）。
3. まとめ
異常なmRNAスプライシングは、さまざまな疾患の発症と密接に関連している。関連薬剤の開発を支援するためには、そのメカニズムを深く理解し、特に効率的かつ正確に病的部位をスクリーニングし、有効な科学的検証を行うことが不可欠である。
Cyagenは、人間遺伝子および遺伝性疾患、動物モデル、細胞株モデルを対象とした全ゲノムレベルのバイオインフォマティクスデータベースを保有しており、機械学習および深層ニューラルネットワーク（DNN）の専門知識と統合することで、人工知能（AI）を活用したモデル選定と設計の新しい時代を推進している。
特に重要なのは、点突然変異細胞株およびマウスモデルを用いることで、突然変異部位の異常スプライシング機構を実験室で確認でき、これはASO治療薬の開発に役立つ。このプロセスにおいて、ミニゲンシステムは、治療効果を持つASO薬の効率的なスクリーニングにも活用できる。
参考文献
[1] Westin, Ida Maria et al. “EYS変異とスプライシングレポーターミニゲンアッセイを用いたスウェーデン北部におけるEYS関連網膜色素変性症の変異分類.” *Scientific Reports* 11, 1 7696. 2021年4月8日.
[2] Gaildrat, Pascaline et al. “未分類遺伝変異のスプライシングへの影響を評価するためのスプライシングレポーターミニゲンアッセイの利用.” *Methods in Molecular Biology* (Clifton, N.J.) 653 (2010): 249-257.
