マウスゲノムにおける「セーフハーバー」領域として知られる ROSA26
「セーフハーバー」という言葉を聞いたとき、まず思い浮かぶのは船の安全な港でしょうか。しかし、本稿で取り上げる「セーフハーバー」とは、マウスゲノム内における外因性遺伝子の標的統合に適した安定した遺伝子座を指します。ここでは、マウスゲノムにおいて最も確立されたセーフハーバーの一つであるROSA26について探求していきます。
ランダム統合の課題
細胞系やモデル生物を用いて遺伝子機能を研究する際、通常は gain of function（機能獲得）または loss of function（機能喪失）の戦略を採用します。機能獲得は通常、遺伝子ノックイン（KI）技術により遺伝子の過剰発現を実現し、機能喪失は遺伝子ノックアウト（KO）によって達成されます。本稿では主にノックイン、すなわち過剰発現モデルについて述べます。遺伝子ノックイン（KI）とは、トランスジェニック法または相同組換え技術を用いて、外因性の機能遺伝子または断片をゲノムに挿入し、細胞内で機能可能とする技術を指します。
従来のトランスジェニック技術により作製されたマウスでは、導入遺伝子がゲノム内でランダムに統合されるため、統合部位ごとにコピー数が不確定となり、安定したタンパク質発現を示す個体の選抜が必要となります。さらに、1世代目のマウスにおいては、コピー数の希釈や統合部位周辺遺伝子のシャットダウン（サイレンシング）といった要因により、表現型が伝代中に消失しやすいため、系統の確立や繰り返し実験に大きな支障をきたすことがあります。
外因性遺伝子が安定かつ高発現を維持し、周辺遺伝子の発現に影響を与えないような遺伝子座は存在するのでしょうか？安定した遺伝子発現を獲得するために、スクリーニングを必要とせずに、信頼性の高い「セーフハーバー」を提供する必要があります。このような「セーフハーバー」では、外因性遺伝子が安定かつ効率的に発現し、関連細胞および組織の通常の機能に何ら支障をきたさないことが求められます。
ROSA26の発見
研究者たちはマウスゲノム内の多数の遺伝子挿入部位を検証した結果、DNAの挿入が非常に安全かつ安定である特殊な部位を発見しました。その中には、ROSA26「セーフハーバー」locusも含まれます。ROSA26の同定は、遺伝子工学の歴史において最も画期的な発見の一つであり、遺伝学の歴史においても最も重要なブレークスルーの一つとされています。
ROSA26は、FriedrichとSorianoがマウス胚性幹細胞（ESCs）における遺伝子変異を研究していた際に発見されました。科学界では正式名称「gene trap ROSA 26 [Gt(ROSA)26Sor]」として知られています。ROSA26はマウス染色体6番に位置する非コード遺伝子で、3つのエクソンから構成されており、遺伝子の挿入に適した領域です。ROSA26遺伝子は、既知の機能性タンパク質をコードしていません。また、この領域は相同組換え（HR）が容易に実施でき、挿入された遺伝子構成体のタンパク質発現レベルが維持され、他の内因性遺伝子の発現や機能に影響を及ぼさない特徴を持っています。その全細胞型および発生段階にわたる広範な発現特性から、ROSA26領域はマウスモデルにおける遺伝子標的化に広く用いられる安全な挿入部位として知られています。
ROSA26遺伝子ノックインモデルの分類
一般的に、ROSA26領域へのノックイン（KI）には以下の3種類のタイプがあります：
- 第一のタイプは、元祖バージョンであり、ノックイン遺伝子のcDNAがROSA26プロモーターによって制御され、体内で恒常的に発現するものです（図a）。具体的には、ROSA26遺伝子の第1イントロン内のXbA1制限酵素切断部位に、cDNAのスプライス受容者（SA）配列を挿入します。その上流に、ネオマイシン耐性遺伝子（NeoR、正選択マーカー）と3つのポリA（pA）からなるストップキャッスルを挿入しています。
- 第二の戦略は、条件付きノックイン（cKI）であり、第一の戦略の変種です。ストップキャッスルの両側にloxP配列を挿入することで実現します（図b）。この場合、終止ボックスが存在することで、転写遺伝子の発現が阻止されます。CRE発現マウスと交配することで、選択的組織において相同組換え（HR）により終止ボックス配列が除去され、発現が開始されます。使用するCREマウス系統によって、発現の組織特異性が異なります。ただし、天然のROSA26プロモーターの強度はやや弱いため、目的の発現レベルが得られない場合もあります。
- 天然のROSA26プロモーターの制限を克服するため、第三の戦略として、外因性プロモーターまたは増強子（例：CAGプロモーター）を導入し、高発現を達成する方法があります（図c）。また、転写遺伝子の下流に、FRT配列を両側に有するIRES-GFPボックスをクローン化することで、体内での発現可視化が可能になります。
04 自閉症スペクトラム障害（ASD）モデル
Tbx1マウス（E1-E2ノックアウト）
左：発声の頻度と持続時間
右：Tマス spontaneous alternation behavior（SAB）[6]
Shank3Bマウス（E13-E16ノックアウト）
Cntnap2マウス（E1ノックアウト）
05 Cyagenの自閉症研究マウスモデル
| 遺伝子 | ノックアウト領域 | 製品番号 | 系統名 |
|---|---|---|---|
| TBX1 | エクソン3 | S-CKO-17545 | C57BL/6J-Tbx1em1(flox)Cya |
| SHANK3 | エクソン4-9 | S-KO-11106 | C57BL/6J-Shank3em1Cya |
| エクソン13-16 | S-KO-16224 | C57BL/6J-Shank3em1Cya | |
| エクソン4-9 | S-CKO-12419 | C57BL/6J-Shank3em1(flox)Cya | |
| Cntnap2 | エクソン3 | S-KO-15901 | C57BL/6J-Cntnap2em1Cya |
| エクソン3 | S-CKO-17468 | C57BL/6J-Cntnap2em1(flox)Cya |
