SH-SY5Y細胞の培養および編集プロトコル
SH-SY5Y細胞株は、神経変性疾患研究において最も広く用いられている細胞モデルの一つです。本記事では、SH-SY5Y細胞株を研究に活用する方法について、遺伝子編集および細胞培養のプロトコルを含めて詳しく解説します。
SH-SY5Y細胞株の応用について
近年、SH-SY5Y細胞は免疫学、神経変性疾患、神経毒性研究などに関連するin vitroモデルとして広く利用されています。脳内のコレステロール濃度が高くなると、β-アミロイド（Aβ）の蓄積や酸化的ストレスが促進されることが報告されています。SH-SY5Y細胞は、特定の化合物を添加することで機能性ニューロンへと分化可能なため、脳疾患のモデルとして有用です。ある研究では、高コレステロール環境がニューロンに与える影響のメカニズムを解明するために、SH-SY5Y細胞を用いて検証が行われました。[1]
画像出典：『Translational neurodegeneration』
（https://doi.org/10.1186/s40035-023-00343-3）
SH-SY5Y細胞とは
細胞株モデル名：SH-SY5Y（ヒト神経芽腫細胞）
カタログ番号：ATCC CRL-2266
増殖特性：集塊状または凝集体として成長し、一部は懸濁状態を維持
培養条件：MEM/F12 + 10% FBS + グルタミン + NEAA + ナトリウムピルビネート
培養環境：95%空気 + 5%CO₂；37°C
SH-SY5Y細胞株は、神経芽腫細胞株SK-N-SH（ATCC HTB-11）の第3クローンから派生した亜株であり、SK-N-SH → SH-SY → SH-SY5 → SH-SY5Yの経路を経て発展しました。SK-N-SHは1970年に4歳の乳児患者から摘出された転移性骨腫瘍から樹立されました。成熟ニューロンは分裂不能である一方、SH-SY5Y細胞は持続的な増殖が可能なため、神経変性疾患研究における最も広く用いられている細胞モデルの一つとなっています。未分化状態では神経芽細胞様の形態を示し、未成熟ニューロンマーカーを発現します。遺伝子編集済みSH-SY5Y細胞株は、薬理学および神経科学分野における研究ツールとしてますます重要性を増しています。
SH-SY5Y細胞の応用分野
➢ 神経変性疾患研究
アルツハイマー病：β-アミロイド（Aβ）やタウタンパク質の蓄積がニューロンに与える毒性作用の解析に用いられる。
パーキンソン病：ドパミン作動性ニューロンの機能およびα-シヌクレインの凝集現象の解明に活用される。
➢ 神経毒性研究
各種化学物質、薬剤、環境毒物がニューロンに与える毒性作用の評価に用いられる。
➢ ニューロン分化研究
レチノイン酸（RA）やその他の化学誘導剤を用いて、SH-SY5Y細胞をニューロン様細胞に誘導可能であり、ニューロン分化および成熟のメカニズム研究に有用なモデルとなる。
➢ 遺伝子機能解析
遺伝子ノックアウト、過剰発現、RNA干渉などの手法を用いて、特定遺伝子がニューロン機能や疾患に果たす役割を検討する。
➢ シグナル伝達経路解析
カルシウムシグナル、MAPK/ERK経路、PI3K/Akt経路など、ニューロンにおけるシグナル伝達経路の解析に用いられる。
SH-SY5Y細胞の培養法
実際の培養において、SH-SY5Y細胞は比較的感度が高く、増殖速度が遅いため、単クローンの作成が困難です。SH-SY5Y細胞の安定性および実験結果の信頼性を確保するためには、この細胞株に特有のニーズを満たす効果的な培養技術を習得することが不可欠です。
細胞培養手順
1. 細胞の解凍
- 遠心管に完全培地6 mLを加え、解凍プロセスを開始する。
- 水浴中で氷が僅かに残る程度まで解凍後、水浴を停止する。
- 細胞懸濁液を遠心管に移し、遠心分離を行う。
- 細胞を再懸濁し、適切なサイズの培養皿に接种する。
- 24時間後に細胞の接着状態を確認し、培地を一度交換する。
2. 細胞の移植（パスージング）
- 上清を吸引・廃棄し、室温のPBSで洗浄を1回行う。
- トリプシンを培養皿底部を均一に覆うように加える。
- 培養皿を軽く叩いた際に細胞が剥離し始めたら、消化を停止する。
- 軽くピペットで再懸濁し、遠心管に移して遠心分離を行う。
- 新規培地で再懸濁し、希望する比率で再接种する。
3. 細胞の凍結保存
- 消化・遠心分離により細胞ペレットを回収する。
- 凍結保存液に細胞を再懸濁し、クライオビアルに移す。
- 冷蔵（4°C）された制御冷却容器にクライオビアルをセットし、翌日まで-80°C冷凍庫で保管する。
- 翌日、クライオビアルを液体窒素に移す。
一般的な培養注意事項
- パスージング比率：高比率および低密度での培養を避ける。過剰なパスージングや低密度での培養は避けること。1:2または1:3のパスージング比率が最適。密度が低いほど増殖速度は遅くなる。
- 過剰増殖：細胞が過剰に増殖すると、凝集体となり徐々に剥離する傾向がある。剥離が開始する前にパスージングを行うことが重要。
- 細胞凝集体：パスージング時に細胞凝集体が残る場合がある。ピペット操作の際は適度な力を加えること。
- 培地：細胞密度が高いほど培地の消費が速くなる。健全な細胞増殖を維持するため、適切なタイミングで培地交換またはパスージングを行うこと。
Smart-Targeted Gene Editing™を用いたSH-SY5Y細胞株の遺伝子編集
遺伝子改変プロジェクト
SH-SY5Y細胞株における代表的な遺伝子改変には、ノックアウト（KO）、ポイントミューテーション（PM）、ノックイン（KI）、過剰発現（OE）、干渉（RNAi）などがある。Cyagenは、単クローンの遺伝子編集SH-SY5Y細胞株の作成を可能にするため、準備および単クローン化条件を最適化しており、実験の正確性と信頼性を大幅に向上させています。このアプローチは、神経科学研究の基盤を強化し、ニューロン機能や疾患メカニズムに関するより精密な研究を可能にします。
➢ ノックアウト
Smart-Targeted Gene Editing™システムに基づき、CyagenはカスタムSH-SY5Y KO（ノックアウト）細胞株サービスを提供しており、単クローンのヘモジゴス型株を納品可能です。最適化されたトランスフェクションシステムを用いて、RNP（リボヌクレオタンパク質）を直接細胞に導入し、ガイド分子による切断効率が90%以上を達成しています。プラスミドやウイルスを介したターゲット遺伝子編集／Cas法と比較して、切断効率を著しく向上させるとともに、オフターゲット効果を大幅に低減し、ターゲットDNA配列のより正確な切断を実現しています。
➢ ポイントミューテーション
Smart-Targeted Gene Editing™システムを用いて、SH-SY5Y細胞株における高精度・高効率なポイントミューテーションおよびノックイン（KI）カスタムサービスを提供しています。最適化されたαドナー系、ヒト化Casタンパク質、ガイド分子、およびドナーディエスを同時にトランスフェクションすることで、同源還元（HDR）効率が最大49%に達します。単クローンのヘモジゴス型株の提供が可能となり、高度な研究に向けた強力なツールを提供します。
➢ 安定細胞株
Cyagenは、トランスフェクションベクター系を最適化・アップグレードし、長年の細胞生物学における経験を活かして、成熟した安定した過剰発現実験システムを確立しました。外因性遺伝子またはRNA干渉要素を安定発現するSH-SY5Y安定細胞プールまたは単クローン細胞株を提供しており、タンパク質発現量が10倍以上向上しています。研究者にとって、一貫した遺伝子発現解析に不可欠な信頼性の高いツールを提供しています。
遺伝子編集の注意事項
- 細胞準備：トランスフェクション前に細胞が良好な状態であることを確認し、細胞密度を約70%に保つこと。顕微鏡下では、細胞凝集体が多すぎないよう注意すること。
- 細胞分散：消化時に細胞をできるだけ単一細胞状態に分散させること。
- 単クローン作成：限界希釈法を用いて単クローンを作成する。Cyagenのカスタム培地を用い、血清を10%追加し、適切なサイトカインを添加する。クローンが観察されたら、新規培地で補充し、継続培養を行う。
- クローン拡大：SH-SY5Y細胞は低密度では増殖が遅いため、単クローンの拡大は段階的に行うことを推奨。まず96ウェルプレートから24ウェルプレートへ、次に12ウェルプレート、最終的に6ウェルプレートへと段階的に移行すること。大容量培養皿への直接移行は避けること。
遺伝子改変プロジェクト
SH-SY5Y細胞株における代表的な遺伝子改変には、ノックアウト（KO）、ポイントミューテーション（PM）、ノックイン（KI）、過剰発現（OE）、干渉（RNAi）などがある。Cyagenは、単クローンの遺伝子編集SH-SY5Y細胞株の作成を可能にするため、準備および単クローン化条件を最適化しており、実験の正確性と信頼性を大幅に向上させています。このアプローチは、神経科学研究の基盤を強化し、ニューロン機能や疾患メカニズムに関するより精密な研究を可能にします。
➢ ノックアウト
Smart-Targeted Gene Editing™システムに基づき、CyagenはカスタムSH-SY5Y KO（ノックアウト）細胞株サービスを提供しており、単クローンのヘモジゴス型株を納品可能です。最適化されたトランスフェクションシステムを用いて、RNP（リボヌクレオタンパク質）を直接細胞に導入し、ガイド分子による切断効率が90%以上を達成しています。プラスミドやウイルスを介したターゲット遺伝子編集／Cas法と比較して、切断効率を著しく向上させるとともに、オフターゲット効果を大幅に低減し、ターゲットDNA配列のより正確な切断を実現しています。
➢ ポイントミューテーション
Smart-Targeted Gene Editing™システムを用いて、SH-SY5Y細胞株における高精度・高効率なポイントミューテーションおよびノックイン（KI）カスタムサービスを提供しています。最適化されたαドナー系、ヒト化Casタンパク質、ガイド分子、およびドナーディエスを同時にトランスフェクションすることで、同源還元（HDR）効率が最大49%に達します。単クローンのヘモジゴス型株の提供が可能となり、高度な研究に向けた強力なツールを提供します。
➢ 安定細胞株
Cyagenは、トランスフェクションベクター系を最適化・アップグレードし、長年の細胞生物学における経験を活かして、成熟した安定した過剰発現実験システムを確立しました。外因性遺伝子またはRNA干渉要素を安定発現するSH-SY5Y安定細胞プールまたは単クローン細胞株を提供しており、タンパク質発現量が10倍以上向上しています。研究者にとって、一貫した遺伝子発現解析に不可欠な信頼性の高いツールを提供しています。
遺伝子編集の注意事項
- 細胞準備：トランスフェクション前に細胞が良好な状態であることを確認し、細胞密度を約70%に保つこと。顕微鏡下では、細胞凝集体が多すぎないよう注意すること。
- 細胞分散：消化時に細胞をできるだけ単一細胞状態に分散させること。
- 単クローン作成：限界希釈法を用いて単クローンを作成する。Cyagenのカスタム培地を用い、血清を10%追加し、適切なサイトカインを添加する。クローンが観察されたら、新規培地で補充し、継続培養を行う。
- クローン拡大：SH-SY5Y細胞は低密度では増殖が遅いため、単クローンの拡大は段階的に行うことを推奨。まず96ウェルプレートから24ウェルプレートへ、次に12ウェルプレート、最終的に6ウェルプレートへと段階的に移行すること。大容量培養皿への直接移行は避けること。
Cyagenによるカスタム細胞株遺伝子編集サービス
Cyagenは、iPSC遺伝子編集
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参考文献
[1] de Dios, Cristina., de Dios, Cristina., de Dios, Cristina., Abadin, Xenia., and Roca-Agujetas, Vicente.. "Inflammasome activation under high cholesterol load triggers a protective microglial phenotype while promoting neuronal pyroptosis." Translational neurodegeneration.
