脊髄小脳変性症型3型（SCA3）研究用モデル—B6-hATXN3マウス
脊髄小脳失調症
脊髄小脳失調症（Spinocerebellar Ataxia, SCA）は、常染色体優性遺伝性の脳疾患群であり、進行性かつ進行性の神経変性を特徴とする。これらの疾患は主に小脳による運動協調機能の制御に影響を及ぼし、場合によっては脊髄にも影響を及ぼす。現在までに40種類以上のサブタイプが同定されており、それぞれが特定の病原因遺伝子と関連している[1]。SCAの主な症状は、歩行の協調性の徐々な低下であり、手の運動協調障害、発音障害、眼球運動障害を伴うことが一般的である。症状の詳細はサブタイプや患者個体差によって異なる。多くの場合、認知機能は保持されているものの、運動制御能力が徐々に喪失し、運動不能に至り、場合によっては死亡に至ることもある。
図1：脊髄小脳失調症（SCA）の世界的分布[1]
脊髄小脳失調症（SCA）の発症機構
脊髄小脳失調症（SCA）は、主に遺伝子内にシトシン-アデニン-グアニン（CAG）三塩基反復の拡張が原因である。これはポリグルタミン（polyQ）疾患群に分類される特徴である。SCA1、SCA2、SCA3など、多くのSCAサブタイプがこのカテゴリーに含まれる。これらの疾患の発症メカニズムは、病原因となるポリグルタミン反復配列の長さが増加することで、翻訳時に異常なポリQ配列を含むタンパク質が産生されることに起因する。この異常タンパク質は折りたたみ異常を起こし、凝集体を形成することで細胞機能を障害し、細胞障害性を引き起こし、最終的に細胞死を招く。その他の遺伝的変異として、点突然変異、欠失、挿入などが特定遺伝子座で報告されるが、これはまれである。脊髄小脳失調症型3（SCA3）は、マチャド・ジョゼフ病（Machado-Joseph Disease, MJD）とも呼ばれ、世界で最も一般的かつ重症なSCAサブタイプであり、全SCA症例の約20～50％を占めているが、現在までに根本的な治療法は確立されていない[2]。
図2：正常なCAG三塩基反復の機能と、異常なCAG反復拡張がSCA発症に及ぼす影響[2]
SCA3の病態メカニズムおよび標的療法に関する研究
ヒト体内では、ATXN3遺伝子内のCAG反復数は通常10～44回であるが、SCA3患者では61～87回にまで拡張する。この過剰なCAG反復は、変異したATXN3遺伝子が異常なアタキシン-3タンパク質を産生することを引き起こす。アタキシン-3タンパク質は、過剰または損傷したタンパク質を分解・除去する「ユビキチン-プロテアソーム系（UPS）」に重要な役割を果たしている。異常なアタキシン-3タンパク質が凝集体を形成することで、毒性物質が蓄積し始め、アテロファジー、タンパク質ホメオスタシス、転写、ミトコンドリア機能、シグナル伝達など複数の細胞プロセスが障害され、機能障害を引き起こし、病態の発症を示す。患者の臨床症状には、小脳性運動失調、眼球運動麻痺、眼振（Gaze-evoked nystagmus, GEN）、瞼の陥没、嚥下障害、顔面および舌筋のけいれん、および脊髄側索症状や副運動系症状を含むさまざまな程度の運動障害、末梢神経障害が含まれる[3]。
図3：ATXN3遺伝子内のCAG反復数の変動がアタキシン-3タンパク質機能に与える影響[3]
現在の前臨床研究において、いくつかのアプローチにより治療効果が確認されている。具体的には、ATXN3遺伝子の発現抑制、病原因ATXN3タンパク質のスプライシング制御、タンパク質凝集体の防止、毒性タンパク質の分解阻害、および障害された細胞系の機能回復などである。[3] しかし、SCA3に対する臨床評価段階にまで到達した治療法は極めて限られており、さらなる研究とモデル開発の必要性が示されている。治療アプローチに応じて、それぞれの治療法は臨床試験に進む前に、適切な動物モデルを用いて厳密に評価される必要がある。たとえば、小核酸薬専門企業であるIonis Pharmaceuticalsは、ATXN3標的のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）療法の開発において、ヒトATXN3遺伝子を発現する多様なマウスモデルを用いてターゲット分子のスクリーニングおよび薬理学的検証を行っている[4-7]。
図4：ATXN3 mRNAまたはATXN3タンパク質を標的とした、SCA3治療法の多様なアプローチ[3]
Cyagenは、ヒト化Atxn3遺伝子を導入したヒト化B6-hATXN3マウスモデル（製品番号：C001398）を成功裏に開発した。このモデルは、ヒトATXN3遺伝子に特有の病原因変異（ホットスポット）を導入することでカスタマイズ可能であり、標的遺伝子編集、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）、小分子干渉RNA（siRNA）、マイクロRNA（miRNA）など、次世代治療法の研究ニーズに応えることができる。以下に本モデルの詳細仕様を示す。
B6-hATXN3マウスはヒトATXN3遺伝子を効果的に発現
一般的に用いられるB6-TG(ATXN3-84Q)マウスは、ヒトATXN3遺伝子とマウスAtxn3遺伝子の両方を発現している。RT-qPCRの結果、B6-hATXN3マウスにおけるヒトATXN3遺伝子発現レベルは、B6-TG(ATXN3-84Q)マウスとほぼ同等である。さらに、B6-hATXN3マウスはヒト遺伝子のみを発現しており、マウスの内因性Atxn3遺伝子は発現していない。
図5：野生型マウス（B6N）、B6-hATXN3マウス、B6-TG(ATXN3-84Q)マウスにおける遺伝子発現の検出
B6-hATXN3マウスは脳内にヒトATXN3タンパク質を発現
ウェスタンブロット解析の結果、野生型マウスの脳にはマウスATXN3タンパク質（約42 kDa）のみが検出されるが、B6-hATXN3マウスの脳ではヒトATXN3タンパク質（約48 kDa）のみが発現している。 一方、B6-TG(ATXN3-84Q)マウスモデルの脳組織では、伸長したポリQ構造を有するヒトATXN3-84Qタンパク質（約65 kDa）とマウスATXN3タンパク質（約42 kDa）の両方が発現しており、2つのバンドが確認された。
図6：マウス脳組織におけるヒトATXN3タンパク質発現のウェスタンブロット（WB）検出
結論
B6-hATXN3マウスモデル（製品番号：C001398）は、ヒトATXN3遺伝子を効果的に発現しており、マウス内因性Atxn3遺伝子の発現は認められない。脳組織におけるヒトATXN3タンパク質の発現も顕著である。一般的に用いられるB6-TG(ATXN3-84Q)マウスモデルは、ヒトATXN3遺伝子とマウスAtxn3遺伝子の両方を発現しているため、研究発見から臨床応用への効率的な移行に課題が生じる可能性がある。したがって、B6-hATXN3マウスモデルは、脊髄小脳失調症型3（SCA3）の病態研究および新規治療薬の発見に有効なツールとなる。
さらに、Cyagenは独自のTurboKnockout融合BAC再結合技術を活用し、本ヒト化モデルを基に、患者特有の変異やヒト病原因変異のホットスポットを導入した点突然変異モデルをカスタマイズ提供可能である。これにより、SCA3研究者による薬剤スクリーニングおよび薬理効果実験のニーズに柔軟に対応できる。
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参考文献：
[1] Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Spinocerebellar ataxia. Nat Rev Dis Primers. 2019 Apr 11;5(1):24.
[2] Sullivan R, Yau WY, O'Connor E, Houlden H. Spinocerebellar ataxia: an update. J Neurol. 2019 Feb;266(2):533-544. doi: 10.1007/s00415-018-9076-4. Epub 2018 Oct 3.
[3] Matos CA, de Almeida LP, Nóbrega C. Machado-Joseph disease/spinocerebellar ataxia type 3: lessons from disease pathogenesis and clues into therapy. J Neurochem. 2019 Jan;148(1):8-28.
[4] Moore LR, Rajpal G, Dillingham IT, Qutob M, Blumenstein KG, Gattis D, Hung G, Kordasiewicz HB, Paulson HL, McLoughlin HS. Evaluation of Antisense Oligonucleotides Targeting ATXN3 in SCA3 Mouse Models. Mol Ther Nucleic Acids. 2017 Jun 16;7:200-210.
[5] Toonen LJA, Rigo F, van Attikum H, van Roon-Mom WMC. Antisense Oligonucleotide-Mediated Removal of the Polyglutamine Repeat in Spinocerebellar Ataxia Type 3 Mice. Mol Ther Nucleic Acids. 2017 Sep 15;8:232-242.
[6] McLoughlin HS, Moore LR, Chopra R, Komlo R, McKenzie M, Blumenstein KG, Zhao H, Kordasiewicz HB, Shakkottai VG, Paulson HL. Oligonucleotide therapy mitigates disease in spinocerebellar ataxia type 3 mice. Ann Neurol. 2018 Jul;84(1):64-77.
[7] McLoughlin HS, Gundry K, Rainwater O, Schuster KH, Wellik IG, Zalon AJ, Benneyworth MA, Eberly LE, Öz G. Antisense Oligonucleotide Silencing Reverses Abnormal Neurochemistry in Spinocerebellar Ataxia 3 Mice. Ann Neurol. 2023 Oct;94(4):658-671.
