疾患研究向けiPSCにおける標的遺伝子編集
誘導多能性幹細胞(iPSC)は、成体細胞を再プログラミングすることで生成される多能性幹細胞です[1]。iPSCの機能は胚性幹細胞(ES細胞)と類似しており、優れた分化能を有し、元の細胞の遺伝的背景と一致します。特定の条件下では、iPSCは再び特定の細胞または組織へ分化可能です。一般的な幹細胞と比較して、iPSCは倫理的問題が少なく、多様な由来から入手可能であり、免疫拒絶反応を回避できるという利点を有しています。
近年、ターゲット遺伝子編集技術を活用したiPS細胞の遺伝子編集は、ますます注目を集めています。これは疾患モデルの構築および病態研究、細胞治療、新薬開発および評価などにおいて高い応用可能性を有しています。ターゲット遺伝子編集技術は、幹細胞生物学および臨床再生医療分野全体に新たな研究アイデアを提示しています。以下では、iPS細胞の背景と遺伝子編集技術との融合的活用について紹介します。
体細胞を誘導多能性幹細胞へ再プログラミング
原理
誘導多能性幹細胞(iPSC)を生成する原理は、特定の転写因子を体細胞に導入し、多能性遺伝子の発現を活性化させ、体細胞をiPSCへ再プログラミングすることです。現在、一般的に使用されている転写因子にはOct4、Sox2、Klf4、c-Mycが含まれます[2]。
再プログラミング戦略
転写因子の遺伝子配列は、レトロウイルスまたはレンチウイルスシステムを用いて宿主細胞（例：線維芽細胞）に統合され、長期的に安定した発現が維持される転写因子は、最終分化した体細胞の再プログラミングを開始します。この方法は誘導効率が高いため優れていますが、生成されたiPSCに腫瘍形成のリスクがあるため、欠点があります。そのため、遺伝子がゲノムに永続的に統合されない代替的な遺伝子送達戦略が用いられ、腫瘍形成リスクを回避しています。具体的には、エピソーム遺伝子ベクター、非統合ウイルスベクター（アデノウイルスなど）、または培養液に転写因子を直接添加して細胞が取り込む方法があります。これらの戦略は多くの場合効果を発揮しますが、iPSC誘導効率はレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターを用いた遺伝子統合法に比べて顕著に低くなります。
再プログラミング効率を向上させるために、一部の研究者らは低分子化合物を追加したり、培養条件を調整しています。例えば、細胞の遺伝子メチル化レベルや特定のシグナル伝達経路に影響を与える低分子化合物を添加することで、再プログラミング効率を向上させることができます。したがって、体細胞誘導プロセスにおいて、低分子化合物の適切な添加は誘導効率の向上に寄与する可能性があります。
また、体細胞の種類、状態、代数などは再プログラミング効率に影響を与える要因です。一般的に高度に分化した細胞ほど誘導効率は低くなります。これは体細胞内で生じるエピジェネティック修飾（メチル化、アセチル化修飾など）に関連しており、必要な再プログラミング条件も変化します。したがって、再プログラミングに適した体細胞を選定することが重要です。最も一般的に使用される体細胞は線維芽細胞であり、採取および培養が容易であるという利点があります。
iPS細胞のスクリーニングおよび識別
体細胞の再プログラミング後は、対象iPSCを確立するため、スクリーニングおよび識別プロセスが必要です。該当種の胚性幹細胞を対照群として用い、分子レベルおよび細胞レベルで検出を実施することで、体細胞がiPSCとして成功裏に再プログラミングされたかどうかを確認できます。
Oct4、Sox2、Nanogなどの多能性マーカー遺伝子の発現レベルは、分子レベルで検出可能です。これらの遺伝子の発現レベルは種によって異なりますが、一般的に高い発現レベルを示します。これらのターゲット遺伝子は免疫蛍光染色により検出でき、陽性信号が観察された場合、多能性を有すると判断します。また、内因性幹細胞マーカープロモーターのメチル化レベルを検出でき、テロメラーゼ活性も検出することで、iPSCの持続性（不老化能力）を確認できます。
細胞レベルでは、細胞形態の観察により確認できます。iPSCはES細胞と形態が類似しており、急速な増殖速度、集落成長、高い核質比、長期的な代数培養、アルカリホスファターゼ（AP）染色陽性反応などの特徴を有します。また、分化能と染色体数形態検査（karyotyping）を実施する必要があります。ターゲット遺伝子の挿入のランダム性により、生成されたiPSCは染色体異常の頻度が高くなる可能性があります。
iPS細胞とターゲット遺伝子編集技術の融合
ターゲット遺伝子編集技術は、ターゲット遺伝子に対して正確かつ効果的にノックアウト、点突然変異、挿入などの編集を実行できます。近年、ターゲット遺伝子編集技術とiPS細胞は、遺伝子研究および疾患治療分野において高い可能性を示しており、両者の融合は研究者に大きな期待を寄せています。
遺伝子編集技術を活用することで、患者由来iPSCの病原因遺伝子を修正し、修正されたiPSCを特定の細胞、組織または臓器へ分化させ、患者に移植することが可能になります。これはiPS細胞と遺伝子編集技術の結合による理想的な治療法です。例えば、皮膚または血液細胞をiPSCへ再プログラミングし、ターゲット遺伝子編集-Pro技術を用いてCISH遺伝子をノックアウトし、CISH−/− iPSCを獲得した後、最終的にCISH−/− iPSC-NK細胞へ分化させました（図1）。実験結果、CISH−/− iPSC-NK細胞は白血病移植モデルにおいて腫瘍成長に対する抑制効果が向上し、生体内での持続性も増加したことが明らかになりました。
図1. 人iPSCからCISH-KO NK細胞の生成。A–B. 正常なCIS発現を示すために、iPSC-NKおよびPB-NK細胞を8時間 cytokine無しで培養後、(A) 100 U/ml IL-2または(B) 10 ng/ml IL-15で所定時間刺激し、免疫ブロット（IB）によりCIS発現を解析した。GAPDHをローディングコントロールとして使用した。C. 2つのガイドRNA（ガイド分子）を用いた、CISH遺伝子エクソン3を標的とする直接および補完鎖に配置されたターゲット遺伝子編集-ProによるCISH KOの概要。D. 人iPSCからクローン性CISH−/− iPSC-NK細胞を導出するための概略図。WT-iPSCでターゲット遺伝子編集-ProによるCISH KOを実施し、クローンレベルでのCISH−/− iPSCの同定を行った。クローン増幅後、CISH−/− iPSCは造血過程を経てCD34+造血前駆細胞へ分化し、その後、既報の方法を用いてCISH−/− iPSC-NK細胞へNK細胞分化させた。E. Sangerシークエンシングにより得られたCISH KOクローンの配列とCISH WT配列（エクソン3、3067～3185）をBLASTにより比較し、両アレルにフレームシフト変異（赤枠）が確認された。すべての変異はガイド分子標的領域に発生した。F. WT-iPSC-NK細胞およびCISH−/− iPSC-NK細胞を10 ng/ml IL-15で8時間刺激し、IBによりCIS発現を評価した。Vinculinをローディングコントロールとして使用した。A、BおよびFのデータは3回の独立実験で繰り返された。 [3]
遺伝子編集が行われたiPS細胞は、多様な細胞、組織、臓器へ分化可能であり、これにより多様な疾患モデルの構築が可能になります。このような疾患モデルは、遺伝子機能研究、疾患メカニズムの解明、新薬スクリーニングなどに活用できます。例えば、Kungらは人iPSCにおいてmiR-26bをノックアウトし、発達過程および疾患における役割を調査しました（図2）。miR-26bノックアウトiPSCは正常な染色体数形態を維持しており、多能性マーカー遺伝子発現および3つの胚葉への分化能を示しました。これは人オルガノイドベースの疾患モデルにおいてmiR-26bの役割を解明するための有意義な実験モデルを提供します。
iPS細胞におけるターゲット遺伝子編集技術の適用課題
ターゲット遺伝子編集技術とiPS細胞はともに広範な応用可能性を有していますが、これを完璧に統合することは決して簡単なことではありません。これは多様な要因の影響を受けるためです。前述の通り、iPS細胞の再プログラミングプロセスは複雑かつ要求が高いため、誘導効率が低く、培養条件が厳密であるといった課題が存在します。同様に、iPS細胞に遺伝子編集を適用する際も、これらの問題が発生します。例えば、遺伝子編集プロセスにおいてiPS細胞の培養条件は一般的な細胞株に比べてはるかに感受性が高く、わずかな不注意でもiPS細胞が分化し、多能性を喪失する可能性があります。また、編集後は単一クローンの選別が困難であり、これによりターゲット外効果（off-target effect）が発生する可能性も高くなります。
Cyagenが提供できるサービス
Cyagenは長年にわたり、細胞遺伝子編集および幹細胞培養技術を保有しており、iPS細胞における遺伝子編集を成功裏に実施した実績があります。例えば、ターゲット遺伝子編集-Pro技術を活用し、iPS細胞においてヒトTNFAIP8L2遺伝子をノックアウトしました。このプロセスにおいて、TNFAIP8L2遺伝子の2番目のイントロンに位置する2つのガイドRNAを設計し、300bpのイントロン欠失を実施しました（図3）。PCRおよび塩基配列解析により、TNFAIP8L2欠失が実現したiPS細胞を確認した後（図4）、免疫蛍光染色によりNANOG、OCT4、SOX2の3つの多能性マーカー遺伝子の発現を確認しました。すべてのマーカーで陽性信号が検出され、これらの欠失細胞が多能性を維持していることが証明されました（図5）。
参考文献
[1] https://www.nature.com/subjects/induced-pluripotent-stem-cells
[2] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006 Aug 25;126(4):663-76. doi: 10.1016/j.cell.2006.07.024. Epub 2006 Aug 10. PMID: 16904174.
[3] Zhu H, Blum RH, Bernareggi D, Ask EH, Wu Z, Hoel HJ, Meng Z, Wu C, Guan KL, Malmberg KJ, Kaufman DS. Metabolic Reprogramming via Deletion of CISH in Human iPSC-Derived NK Cells Promotes In Vivo Persistence and Enhances Anti-tumor Activity. Cell Stem Cell. 2020 Aug 6;27(2):224-237.e6. doi: 10.1016/j.stem.2020.05.008. Epub 2020 Jun 11. PMID: 32531207; PMCID: PMC7415618.
[4] Kung LHW, Sampurno L, Little CB, Lamandé SR, Bateman JF. Generation of a miR-26b stem-loop knockout human iPSC line, MCRIi019-A-1, using Targeted Gene Editing/Cas9 editing. Stem Cell Res. 2020 Dec 10;50:102118. doi: 10.1016/j.scr.2020.102118. Epub ahead of print. PMID: 33316599.
