ターゲット遺伝子編集ノックアウト細胞株の検証方法
亜鉛指核酸酵素（ZFN）や転写活性化因子様効果因子核酸酵素（TALEN）といった初期の遺伝子編集ツールが登場して以来、より多様性と効率性に優れたゲノム改変技術が登場した。その代表例が現在「ターゲット遺伝子編集-Proシステム」として知られる技術である。このシステムは、正確なゲノム改変を可能にするため、研究者間で特に好まれるツールとして急速に普及している。
この技術は、原核生物に見られる侵入性遺伝子要素を認識・中和する防御機構から発展したものである。この機構はエマニュエル・シャルペニエやジェニファー・ダウドナらの研究者によって最初に解明された。その後、フェン・チャンらの研究グループが、このシステムを哺乳類細胞におけるゲノム編集に初めて適用した。
ターゲット遺伝子編集プロセスでは、プログラマブルなガイド成分と関連する核酸酵素を用いて、特定のゲノム領域に標的的な改変を導入する。これにより、幅広い研究応用に応じた効率的かつカスタマイズ可能な遺伝子編集が実現可能となる。
ターゲット遺伝子編集-Proを用いたノックアウト（KO）細胞株モデルを構築する際には、編集された遺伝子変異の検証が不可欠である。ここでは、ターゲット遺伝子編集-Proを用いたノックアウト細胞株モデルの構築における検証方法について詳述する。
ターゲット遺伝子編集-Proシステムの仕組み
ターゲット遺伝子編集-Proシステムは、2つの主要な構成要素からなる。すなわち、プログラマブルな核酸酵素と合成RNA由来のガイド分子である。編集プロセスの初期段階では、単一ガイド分子（sGuide Molecule）が編集酵素と複合体を形成し、配列特異的な標的部位を認識する。その後、転写されたRNA成分（crRNAに類似）が前駆体構造を形成し、同じゲノム領域に酵素を誘導する。
標的部位への切断後、細胞内DNA修復経路の一つであるエラー率の高い非相同末端結合（NHEJ）機構が切断末端を再結合する。この過程で、小さな挿入や欠失（indels）が生じやすく、これが遺伝子の機能を破壊し、遺伝子ノックアウトを達成する。
ターゲット遺伝子編集-Proによる遺伝子ノックアウト戦略
ターゲット遺伝子編集-Proを用いた遺伝子ノックアウトには、主に以下の2つの戦略がある。
1つ目の戦略は、ターゲット遺伝子の機能ドメインを構成する大部分のエクソンをノックアウトすることで、遺伝子を不活性化する方法である。この戦略では、ノックアウト後の機能喪失が確実に得られ、タンパク質残渣の問題も回避できる。しかし、いくつかの課題がある。ターゲット領域が長大な場合、ノックアウトの難易度が上昇する。また、ノックアウト断片が細胞内で遊離し、非相同末端結合（NHEJ）の過程でゲノム内の他の部位にランダムに挿入される可能性があり、ノックアウト陽性率の低下を招く。
2つ目の戦略は、個々のエクソンをノックアウトしてフレームシフトを誘導し、遺伝子ノックアウトを達成する方法である。この戦略は、DNAレベルでのホモ接合ノックアウト細胞株の獲得が比較的容易である。ただし、sGuide Moleculeの設計位置が適切でないと、DNAレベルではフレームシフトとオープンリーディングフレーム（ORF）の変化が生じても、ウェスタンブロット（WB）によるタンパク質発現検出でターゲット遺伝子産物が検出される場合がある。
また、ドナーベクターを導入するような特殊な戦略も存在する。相同組換え（HR）ベクターを導入することで、HRベクター内に終止コドンを導入し、翻訳を停止させる。あるいは、選択マーカーをHRベクターに組み込み、ターゲット遺伝子のコード領域に挿入することで、遺伝子機能を破壊する方法がある。
ターゲット遺伝子編集-Proを用いたノックアウト細胞株の検証方法
ターゲット遺伝子編集によるノックアウト（KO）細胞株が構築された後、その遺伝子改変の正確性を確認する検証が重要である。ノックアウト細胞株の成功を確認するためには、まずゲノムレベルでの変異を検証する必要がある。断片ノックアウトの場合、以下の検証戦略が有効である（図2参照）。sGuide Moleculeの2つの切断部位をそれぞれ囲む領域（領域1と領域2）およびノックアウト領域（領域3）をPCRで増幅するためのプライマーを設計する。sGuide Moleculeの影響を受けた領域でDNAバンドが増幅されず、かつ領域3のバンドが野生型よりも小さくなる場合、細胞株がゲノムレベルでノックアウトされていると判断できる。
sGuide Moleculeによるノックアウトは、通常、小さな挿入・欠失（indels）を生じる。このindelsの数が3の倍数でない場合、フレームシフトを引き起こし、ノックアウトが成立する。一方、アガロースゲル電気泳動は100 bp以上の差異しか識別できないため、indelsの存在を確認できない。したがって、増幅産物の配列解析が必要となる。配列解析結果を野生型と比較し、3の倍数でないindelsが確認された場合、細胞株がゲノムレベルでノックアウトされていると判断できる。
フレームシフト変異のゲノムレベルでの検証に加え、ウェスタンブロット（WB）によるタンパク質発現検証も行うことが推奨される。図5に示すように、ノックアウト細胞株ではターゲットタンパク質の発現が認められなかったことから、ノックアウト細胞株の構築が成功したと結論づけられる。Cyagenの多数の実績から、研究計画の立案段階でターゲット遺伝子、細胞種、後続実験の要件を総合的に考慮し、sGuide Moleculeを適切に設計すれば、フレームシフトノックアウトでも断片ノックアウトでも、理想的な実験結果が得られることが確認されている。
ノックアウト実験を実施する際には、実際の状況に応じた計画を立案することが必要である。 ターゲット遺伝子の性質、細胞種、および後続の実験目的によって、プロトコールの設計や最終的な結果が大きく影響する。ターゲット遺伝子が細胞生存に影響を与える場合、または細胞種によって編集効率が異なる場合、また導入方法の違いが後続実験に影響する場合がある。特に、細胞周期、増殖、代謝に関与する遺伝子をノックアウトすると、細胞が致死的となり、ホモ接合ノックアウト細胞株の獲得が困難になる。また、増殖が遅い細胞種では、DNA修復能が低下し、編集効率が低下するため、ノックアウト実験が困難となる。
ノックアウト細胞株モデル開発におけるターゲット遺伝子編集-Proの導入方法
ターゲット遺伝子編集-Proシステムを細胞に導入する方法として、一般的に以下の3つの手法が用いられている。すなわち、リボ核酸タンパク質（RNP）複合体導入法、プラスミドベクター法、ウイルスベクター媒介法である。
多くの場合、RNP法が推奨される。この方法では、単一ガイド分子（sGuide Molecule）を合成し、体外で編集酵素と複合体を形成した後、電気穿孔により細胞に導入する。この手法は時間的効率が高く、宿主ゲノムに外来遺伝物質を導入せずに、迅速にホモ接合ノックアウト単クローン細胞株を生成できる。
一方、プラスミドおよびウイルスベクター法は、増殖が遅い細胞株に適している。ただし、ウイルス導入法では、外因性プラスミド配列がゲノムに統合される可能性がある。最終的な実験目的に応じて、最適なノックアウト戦略を選定することが重要である。
