XLRPモデルにおけるAAV遺伝子編集が網膜変性を回復
網膜色素変性GTPase調節因子（RPGR）遺伝子の変異はX連鎖網膜色素変性症（XLRP）と関連しており、網膜色素変性症（RP）全体の10～20％を占め、最も重度の形態の一つである。本稿では、RPGR遺伝子変異に起因するXLRPに対する潜在的な遺伝子療法の開発に至るまでの研究プロセスを概説する。
研究者らはRPGR変異マウスモデルを構築した。代表的な表現型を表現型解析により確認した後、再組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）を用いて修復システムを病変モデルマウスに投与した。相同性依存修復（HDR）を用いた解析により、AAV-ターゲットゲノム編集Proを介した遺伝子編集療法が優れた治療効果を示した。本研究は、RPGR遺伝子変異に起因するXLRPに対する新たな遺伝子療法の可能性を示し、この疾患に苦しむ患者に希望をもたらした。
1. 基礎的研究アイデア
❖RPGRノックアウト（KO）マウスモデルを構築。この塩基の欠失により翻訳の早期終了が生じ、ノンアレルとして機能する。表現型解析により、光受容体の変性および光受容体タンパク質の異常発現が確認された。
❖AAV-ターゲットゲノム編集Proを用いた遺伝子編集療法は、光受容体細胞の変性などの症状を効果的に予防・治療可能である。
2. RPGRノックアウトマウスモデルの構築
研究者らはRPGR遺伝子のエクソン8を標的とする2つのsGuide分子を設計した（図1A）。その後、in vitroで転写したCas9 mRNAとsGuide分子をC57BL/6Jマウスの受精卵に注射し、RPGRノックアウトマウスモデルを構築した。Sangerシークエンシング解析により、モデルの成功構築が確認された（図1B）。
次なる研究に向け、エクソン8に5bpの欠失（c.974_978delAAATT；p.K325Nfs*1）を有するマウスを選定した（図1C）。WTマウスと比較して、RPGRの発現および局在を解析した結果、WTマウスでは接続セイル部に杆状の免疫反応が認められ、明るい点状の発現が観察された。一方、RPGRノックアウト網膜ではRPGRの染色は認められなかった（図1D）。したがって、5bp欠失はRPGRの機能不全を引き起こすことが示された。
3. RPGRノックアウトマウスモデルの病変表現型
研究者らは、5bp欠失マウスモデルに対して詳細な表現型解析を実施した。WTおよびRPGRノックアウト（KO）マウスの網膜眼底像を撮像した（図2A）結果、3か月齢のRPGR KOマウスでは、網膜眼底の全四象限に多数の小規模で均等に分布する黄白色斑点が認められた。光受容体の変性が進行するにつれ、これらの斑点は大きくなり、融合を示した。12か月齢では斑点は希薄化したが、過色素沈着が顕著に認められた。
組織学的評価としてWTおよびRPGR KOマウスの網膜断面を解析した結果、6か月齢では外核層（ONL）に軽度の加齢関連光受容体細胞減少が認められた。12か月齢では、RPGR KOマウスにおける光受容体細胞の喪失が顕著に確認された（図2B）。
ONL厚さを測定した結果、WTマウスと変異マウス間で有意な差が認められた（図2C）。形態的変性と並行して、電気視網膜図（ERG）による網膜機能評価も異常を示した。
暗順応ERGにおいて、3か月齢のRPGR KOマウスではWTマウスと有意差は認めなかったが、b波振幅は低下していた（図2D）。6か月齢では、a波およびb波振幅がさらに低下し、12か月齢ではほぼ記録不能なERG反応が観察された（図2E）。
6か月齢のRPGRノックアウト（KO）マウスでは、ロドプシン、M-オプシン、S-オプシンの発現が有意に低下しており、PNA染色も僅かにしか認められなかった。これは外側セグメントの整備性およびタンパク質安定性の低下と一致する。12か月齢のRPGR KOマウスでは、PNAおよびS-オプシン染色がさらに低下し、ロドプシンおよびM-オプシンの発現は僅かに確認されるにとどまった（図3）。
RPGR KOマウスの網膜形態および機能は、徐々に進行する加齢関連網膜変性を示す。6か月齢から顕著な変性変化が開始され、ヒトにおける進行性網膜変性を模倣する可能性が高い。したがって、本RPGRノックアウトマウスモデルは、遺伝子編集療法研究に適した優れた動物モデルシステムである。
4. RPGR変異由来網膜変性はAAV-ターゲットゲノム編集Proによって効果的に治療可能
変異RPGR座標を標的とするsGuide分子発現カセットおよび修復ドナーテンプレートを、2種類の別個のAAV2/8ベクターを用いて6か月齢のRPGR-/yCas9+/WTマウスに投与した（図4A～D）。
5. 結論
本研究は明確な研究構想を有している。まず、進行性網膜変性を再現する代表的なマウスモデルを構築し、表現型的に検証した後、AAVを用いてターゲットゲノム編集Pro修復システムを眼に投与し、効果的な治療を実施した。このように、網膜疾患の治療ターゲットの同定には、有効な疾患モデルの構築が不可欠であることが示された。現在、マウスは遺伝子疾患モデル構築に最も広く用いられている。これは、ヒトゲノムとの高い相同性、低コスト、成熟したモデル構築システムといった要因による。治療法の開発は、通常AAVを用いて有効な遺伝子断片を投与する戦略が採られるが、SNP変異などに対応するターゲットゲノム編集Proを用いた修復戦略の研究開発も継続的に進展している。
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引用文献
