Advancing the Study of Cardiac Chamber Specification During Development & Pathological Remodeling

過去のモデルの課題点

Nppa (natriuretic peptide A) は、心臓の発生中にその時空間的発現が動的に変化する心臓ホルモンです。出生前に、Nppa mRNAの発現はまず心臓の心室に観察され、その後で心耳に発現が移行します。健常な新生児期以降の心臓では、Nppaの発現は心房に限定され、病的ストレスが生じた成人の心室では、胎児遺伝子活性化プログラムの一環として再発現します。

このNppaのユニークな発現パターンにより、Nppa遺伝子は心室の形成および心臓の領域特定、並びに心性肥大や心不全の分子機構を研究する上での重要なマーカーとして広く研究されてきました。本稿では、従来のNppaレポーターマウス系統の持つ限界について明らかにし、心臓の発生および病態研究を改善するための新しいモデルを提示します。

過去に複数のNppaレポーターマウス系統が心房の発生および心腔の特定を研究するために提案されてきましたが、従来のモデルでは内因性Nppaに見られる独自の時空間的発現パターンを正確に再現できていませんでした。以下に、過去の研究で使用された主な2つのNppaレポーターモデルと、それらが心臓の発生研究において持つ限界について説明します。

• 多くの場合、ラット由来のNppaプロモーター断片にレポータージーンを結合させた形の形質導入マウス系統が使用されていました。これらのモデルはNppaレポーターアクティビティを示しましたが、内因性Nppaとは大きく異なる発現パターンを示しました。
• 内因性Nppaの発現パターンにより正確に一致させるために、マウス由来のより広範なNppa cis制御配列を用いてCre組換え酵素の発現を制御するモデルもありました。しかし、レポーター発現は不均一であり、これは完全でないCre組換えが原因であると考えられます。

これらの知見は、形質導入マウスの作成に用いられたNppaの制御配列が、心臓の発生中にNppaの動的発現を制御するために必要なすべての制御配列を網羅していない可能性を示唆しています。さらに、標準的な形質導入法では、レポータージーンが標的ゲノムに非特異的に統合されるため、レポータージーンのコピー数がまちまちになりやすく、非生物学的な発現レベルを引き起こすことがあります。

Nppa-tagBFPレポーターノックインマウス株の作成

従来のモデルが抱える課題を克服するために、エピソード性幹細胞（ESC）を用いた相同組換え法に基づく新しいNppaレポーターマウス系統が作成されました。詳細な作成戦略およびその結果を図1に示します。

図1: Nppa-tagBFPレポーターノックインマウス株の作成。 (a) 遺伝子標的化戦略の模式図。Nppa遺伝子ローカスの3'UTRにIRES-tagBFP-FRT-NeoR-FRTカセットを挿入。NeoR遺伝子カセットは2つのFRTサイトで挟まれている。(b) (a)で示したPCRプライマーを用いた標的化ES細胞のPCRスクリーニング。9クローンが予想されるサイズ（5.3 kb）のPCRバンドを示した。野生型（WT）クローンはバンドを示さなかった。(c) サザンブロット解析による標的化ESクローンの確認。9クローンのうち6クローン（1, 2, 3, 5, 6, 7）を用いて、(a)のプローブおよび制限酵素を用いた解析を実施。Nppa-tagBFPノックインの標的化ES細胞ではSacIで7.6 kb、EcoRIで6.9 kbのバンドを確認。WTではバンドは検出されなかった。

Nppa遺伝子の3'UTRにtagBFPレポーターカセットをノックインすることで、内因性Nppaプロモーター領域を保持しており、形質導入レポーターモデルでよく見られる不適切な制御下でのレポーター発現を排除しています¹。従来の形質導入モデルと比較すると、今回提示されたNppa-tagBFPレポーターノックインマウス株は、出生前および出生後の心臓発生中にわたるNppaの動的かつ複雑な時空間的発現パターンを正確に再現しています。さらに、病的ストレスによりNppa-tagBFPの発現が誘導されるため、心臓の病的リモデリングを可視化する指標としても機能します。また、このノックインアレルをヘテロおよびホモで保有するマウスはいずれも健康で繁殖可能です。以上の理由から、新しいNppa-tagBFPレポーターノックインマウス株は、心臓の発生における心腔形成および特定、並びに心疾患における胎児遺伝子の再活性化の研究において有用なツールとなります。

カスタム遺伝子ターゲティングによるマウスモデルの改善

CyagenのESCを用いた遺伝子ターゲティング技術により、Nppa遺伝子の生物学的な発現レベルを保持しつつ、レポーターシーケンスを特異的に統合することが可能になります。これにより、従来のNppaレポーターモデルの持つ課題を解決し、発生中の心臓の領域特定や病的な心リモデリングの研究に非常に有望な新しいモデルを提供します。Cyagenが提供するさまざまな遺伝子ターゲティング技術は、幅広い疾患の病態モデルにおいて内因性発現パターンを再現するレポーターモデルの作成において同様の利点をもたらす可能性があります。

Cyagenが提供する新しく画期的なESCベースのアプローチであるTurboKnockout^®は、最大6か月でコンディショナルノックアウト、レポーターノックイン、ヒト化マウスの作成を可能にします。これは、自己消去型選択カセットと高効率なES細胞株という2つの革新によって実現されており、これにより2世代分の交配が不要になります。コンディショナルノックアウトの場合、ES細胞由来のファウンダー個体を直接、組織特異的Creマウスと交配させることができます。

さらに、Cyagenは形質導入マウスモデル作成で直面する課題を解決できる遺伝子ターゲティング技術を提供しています。独自のPiggyBAC形質導入マウスサービスは、トランスジェンの配列を正確に統合し、より一貫した発現を実現するシングルコピーの形質導入マウスを提供します。同様の利点をカスタムラットモデルに提供するPiggyBAC形質導入ラットサービスも提供しています。

世界有数のカスタムマウスおよびラットモデルプロバイダーとして、Cyagenは業界最高水準のアフターサポート、効率性、経済性を提供しており、「成果が得られなければ、料金はいただきません」という保証も用意しています。次の動物モデルプロジェクトのための無料で詳細な遺伝子ターゲティング戦略をご依頼ください。Cyagenがどのようにして皆様の研究を支援できるかをご確認ください。

― バンダービルト大学医学部 Dr. Young-Jae Nam

参考文献

1. Zhang, Z., Zhang, Q., Lal, H., & Nam, Y. (2019). Generation of Nppa‐tagBFP reporter knock‐in mouse line for studying cardiac chamber specification. Genesis. doi:10.1002/dvg.23294