コンディショナルノックアウトマウスをどう同定するか？

Cyagen Technical Content Team | July 28, 2020

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遺伝子工学マウス遺伝子型PCR同定の基本原則は遺伝子工学マウスと野生型マウスとのゲノムのシーケンスの違いを利用して、マウスゲノムDNAをテンプレートとしてPCRを行い、ゲル電気泳動比で異なる遺伝子型の特異産物のサイズを比較し、ストリップのサイズによってマウスの異なる遺伝子型を区別することである。今回はコンディショナルノックアウトマウスの同定を紹介します。

F1世代floxマウスのターゲットが正しいか検証する

プライマーの設計

F1/R1は5'armターゲットの正確性を検証し、F2/R2は3'armターゲットの正確性を検証し、F5/R5、F6/R6は両端のloxP部位を検証する。陽性と同定されたマウスが引き続きSouthern Blot検証を行う。

予想される断片サイズ

ストリップ1のサイズ：F1/R1の拡大した5'arm末端であり、野生型の骨組み区域＋相同腕＋loxP+一部のノックアウト区域が含まれる。

ストリップ2のサイズ：F2/R2の拡大した3'arm末端であり、野生型の骨組み区域＋相同腕＋loxP+一部のノックアウト区域が含まれる。

ストリップ3のサイズ：F5/R5の拡大した5'arm末端であり、相同腕＋loxP+一部のノックアウト区域である。

ストリップ4のサイズ：F6/R6の拡大した3'arm末端であり、相同腕＋loxP+一部のノックアウト区域である。

コメント：ストリップ1とストリップ2は相同腕骨組み区域の検証で、サイズは普通2kbで拡大しにくい。サイヤジェン株式会社が出荷する前に検証致しますので、研究者様が検証する必要がありません。

電気泳動の結果

電気泳動を行った後で同時にストリップ1、ストリップ2、ストリップ3、ストリップ4があるなら、陽性floxマウスと判断する。

目的ストリップが出ないなら、陰性マウス（野生型或いは他の突然変異）と判断する。

シークエンシング

PCR同定の以外、産物のシークエンシングも必要である。F1/R1の拡大産物のシークエンシングプライマーはloxP部位に近い5’arm（図示F3）に設定する。F2/R2の拡大産物のシークエンシングプライマーはloxP部位に近い3’arm（図示F4）に設定する。

F2世代マウスのホモヘテロの同定

プライマーの設計

F1世代陽性マウスは出荷する時に既に相同腕ターゲットの正確性を検証された。兄妹交配から得た後代は1kb以下の目的断片を検証すればいい。普通特異性のよいloxPの辺りに設計する。

予想される断片サイズ

ストリップ1のサイズ：F5/R5の拡大した5'arm末端であり、相同腕＋loxP+一部のノックアウト区域である。

ストリップ2のサイズ：F5/R5の拡大した5'arm末端であり、野生型である。

ストリップ3のサイズ：F6/R6の拡大した3'arm末端であり、相同腕＋loxP+一部のノックアウト区域である。

ストリップ4のサイズ：F6/R6の拡大した3'arm末端であり、野生型である。

コメント：F5/R5とF6/R6の間の一つを選んで検証すればいい。

電気泳動の結果

電気泳動を行った後でストリップ1或いはストリップ3だけあるなら、陽性ホモマウス（-/-）と判断する。

電気泳動を行った後でストリップ2或いはストリップ4だけあるなら、野生マウス（+/+）と判断する。

電気泳動を行った後でストリップ1とストリップ2またはストリップ3とストリップ4があるなら、陽性ヘテロマウス（+/-）と判断する。

Creマウスの削除効率を同定する

ホモ或いはヘテロfloxマウスとCreマウスとの後世は削除効率、つまり削除が発生したか同定する必要である。削除効率を検証する前に、Cre遺伝子を同定する。もしマウスの尾がCre陽性なら、特異性組織を取って検証する。

プライマーの設計

5'armと3'armにプライマーを設計する。cKO区域の上流・下流に位置する。

予想される断片サイズ

ストリップ1のサイズ：F5/R7の拡大したターゲットベクター断片である。

ストリップ2のサイズ：F5/R7の拡大した削除後の断片である。

ストリップ3のサイズ：F5/R5の拡大した5'arm末端であり、相同腕＋loxP+一部のノックアウト区域である。

ストリップ4のサイズ：F5/R5の拡大した5'arm末端であり、野生型である。

コメント：F5/R7は断片が多すぎるか、またはゲノムの精製効果が悪いため、ストリップが出ない可能性がある。

電気泳動の結果

電気泳動を行った後でストリップ2だけあるなら、cKOホモマウス（二つの染色体とも削除が発生した）と判断する。

電気泳動を行った後でストリップ2とストリップ4があるなら、cKOヘテロ（1つの染色体が削除が発生した）と判断する。

電気泳動を行った後でストリップ1或いはストリップ3だけあるなら、Cre削除効率が低いか、またはcKO区域で削除が発生しなかったかもしれない。

コメント：電気泳動を行った後で、他の削除不完全が発生する可能性がある。これはCreマウスの削除効率と関わり、また実験試料の選択と関わる。例えば、内皮細胞で削除が発生する場合、試料が精密に取らなくて別の組織があるなら、結果の判断に影響する。

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サイヤジェン株式会社について

サイヤジェン株式会社は15年間の発展を経て、全世界の数万人の科学研究者にサービスを提供しており、製品と技術は直接にCNS (Cell、Nature、Science)の定期刊を含む5,200余りの学術論文に応用されています。弊社の「ノックアウトマウスライブラリ」は低価格だけでなく、遺伝子名称を入力すれば、ワンクリックで注文まで操作できます。ノックアウトマウス、ノックインマウス、コンディショナルノックアウトマウス、トランスジェニックマウス、GFPマウス、免疫不全マウス、無菌マウスなどのカスタマイズサービスを提供する以外、専門的な手術疾患モデルチームがあり、多種の複雑な小動物手術疾患モデルも提供できます。