RAGノックアウトを活用した免疫受容体多様性の解析

RAG1およびRAG2の概要

B細胞が産生する免疫グロブリン（Ig）は、B細胞表面受容体（BCR）および抗体として機能し、T細胞表面受容体（TCR）はT細胞に存在するが、いずれも特定の抗原にのみ特異的に結合する。一方で、これらのタンパク質は、V(D)J再結合によって極めて多様な構造を獲得している。V(D)J再結合は、脊椎動物の早期T細胞およびB細胞の発達成熟過程において、可変（V）、多様性（D）、結合（J）遺伝子領域の再編成により、異なる抗原を認識可能な多様な免疫グロブリンおよびTCRを生成する体細胞再結合機構である。また、再結合活性化遺伝子（RAG）であるRAG1およびRAG2は、それぞれRAG-1およびRAG-2再結合酵素をコードする。RAG1およびRAG2は、発達中のリンホイド細胞に特異的に発現し、適応免疫系の主要な構成要素である。

V(D)J再結合における12/23則

再結合シグナル配列（RSS）は、IgおよびTCRのゲノムDNAにおけるV、D、J領域の両端に存在する。構造的には、RSSは一方の端に7塩基のヘプタマー、他方の端に9塩基のノナマーが配置され、その間に12塩基または23塩基のスパーサー配列が挟まれている。したがって、RSSは2種類に分類される：12塩基スパーサーを有する12-RSSと、23塩基スパーサーを有する23-RSS（図1a）。12/23則とは、V(D)J再結合において、12-RSSは23-RSSとしか結合できず、遺伝子断片の適切な結合を保証するという規則である。例えば、Ig重鎖（IgH）のゲノムDNAでは、VHおよびJH領域はいずれも23-RSSで囲まれているが、DH領域は12-RSSで囲まれているため、12/23則によりVHとJHの直接結合が阻止され、DH領域が再結合に参加することが保証される（図1b）。また、分子レベルでは、12-RSSおよび23-RSSの結合により、より安定したシナプソニマル複合体（シナプシス）の形成が可能となる。

V(D)J再結合の過程において、RAG1/2複合体は、DNA結合を助ける高移動性群ボックス1（HMGB1）の支援を受けて、RSSのヘプタマーとコード領域の接合部に一か所の単鎖切断を正確に導入する。この切断により、コード領域の3'末端に自由なOH基が生成され、その反対鎖のリン酸ジエステル結合に攻撃することでハートピン構造が形成されるとともに、ブランクなシグナル末端が生じる。シグナル末端はRAG1/2複合体に結合したまま保持され、一時的な「切断後複合体」となる。その後、コード末端およびシグナル末端は、非相同末端結合（NHEJ）経路によって処理・連結され、コード接合部および環状化されたシグナル接合部が形成される（図1c）。

(a) RSS構造：12-RSSおよび23-RSS。7塩基のヘプタマーと9塩基のノナマーが、それぞれ12塩基または23塩基のスパーサーで挟まれている。

(b) ヒトIgH、IGK、IGLおよびTCR α、β、γ、δ鎖遺伝子におけるRSSの分布。

(c) V(D)J再結合のメカニズム。

RAG1とRAG2の相違点

RAG1とRAG2の機能的相違点は何か。赤松氏の実験によれば、RSSおよび非特異的DNA配列を用いた場合、RAG-1のRSSへの結合親和性は非特異的DNA配列に対する結合と比較して3〜5倍程度にしか向上しなかった。一方、RAG-2については、実験的にDNAへの結合が観察されなかった。しかし、RAG1とRAG2が共存する場合、両者はDNAと結合するRAG1/2複合体を形成し、RAG1-DNA複合体よりも安定性および特異性が高く、V(D)J再結合における切断活性を示す。この結果から、RAG2はRAG1によるDNA認識を支援する役割を果たしており、RSSの効率的な結合および認識にはRAG1とRAG2の同時存在が不可欠であることが示唆される[2]。

まとめ

RAG-1およびRAG-2再結合酵素は、T細胞およびB細胞の発達および成熟、ならびに免疫グロブリン産生において不可欠な役割を果たす。V(D)J再結合において、RAG1/2複合体はRSSの認識および切断に関与する。したがって、PrkdcSCID遺伝子変異を持つマウスとは異なり、Rag1およびRag2ノックアウト（KO）マウスはV(D)J再結合経路が障害され、機能的なT細胞およびB細胞、ならびに免疫グロブリンが欠如しており、「漏れ（leakiness）」を示さない。免疫漏れの発生頻度は、SCIDマウスの遺伝的背景によって異なる。一般的に、C57BL/6JおよびBALB/c背景では高い漏れ率を示すが、C3H背景では低く、NOD背景では極めて低い。ただし、免疫漏れを引き起こす分子機構については、現在までに明らかになっていない。

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参考文献

[1] Nishana, M., & Raghavan, S. C. (2012). Role of recombination activating genes in the generation of antigen receptor diversity and beyond. Immunology, 137(4), 271–281.

[2] Akamatsu Y, Oettinger MA. (1998). Distinct roles of RAG1 and RAG2 in binding the V(D)J recombination signal sequences. Mol Cell Biol, 18(8):4670-8.