RAGノックアウトを活用した免疫受容体多様性の解析

RAG1およびRAG2の概要

B細胞が産生する免疫グロブリン（Ig）は、B細胞表面受容体（BCR）および抗体として機能し、T細胞表面受容体（TCR）はT細胞に存在するが、いずれも特定の抗原にのみ特異的に結合する。一方で、これらのタンパク質は、V(D)J再結合によって極めて多様な構造を獲得している。V(D)J再結合は、脊椎動物の早期T細胞およびB細胞の発達成熟過程において、可変（V）、多様性（D）、結合（J）遺伝子領域の再編成により、異なる抗原を認識可能な多様な免疫グロブリンおよびTCRを生成する体細胞再結合機構である。また、再結合活性化遺伝子（RAG）であるRAG1およびRAG2は、それぞれRAG-1およびRAG-2再結合酵素をコードする。RAG1およびRAG2は、発達中のリンホイド細胞に特異的に発現し、適応免疫系の主要な構成要素である。

V(D)J再結合における12/23則

再結合シグナル配列（RSS）は、IgおよびTCRのゲノムDNAにおけるV、D、J領域の両端に存在する。構造的には、RSSは一方の端に7塩基のヘプタマー、他方の端に9塩基のノナマーが配置され、その間に12塩基または23塩基のスパーサー配列が挟まれている。したがって、RSSは2種類に分類される：12塩基スパーサーを有する12-RSSと、23塩基スパーサーを有する23-RSS（図1a）。12/23則とは、V(D)J再結合において、12-RSSは23-RSSとしか結合できず、遺伝子断片の適切な結合を保証するという規則である。例えば、Ig重鎖（IgH）のゲノムDNAでは、VHおよびJH領域はいずれも23-RSSで囲まれているが、DH領域は12-RSSで囲まれているため、12/23則によりVHとJHの直接結合が阻止され、DH領域が再結合に参加することが保証される（図1b）。また、分子レベルでは、12-RSSおよび23-RSSの結合により、より安定したシナプソニマル複合体（シナプシス）の形成が可能となる。

V(D)J再結合の過程において、RAG1/2複合体は、DNA結合を助ける高移動性群ボックス1（HMGB1）の支援を受けて、RSSのヘプタマーとコード領域の接合部に一か所の単鎖切断を正確に導入する。この切断により、コード領域の3'末端に自由なOH基が生成され、その反対鎖のリン酸ジエステル結合に攻撃することでハートピン構造が形成されるとともに、ブランクなシグナル末端が生じる。シグナル末端はRAG1/2複合体に結合したまま保持され、一時的な「切断後複合体」となる。その後、コード末端およびシグナル末端は、非相同末端結合（NHEJ）経路によって処理・連結され、コード接合部および環状化されたシグナル接合部が形成される（図1c）。

(a) RSS構造：12-RSSおよび23-RSS。7塩基のヘプタマーと9塩基のノナマーが、それぞれ12塩基または23塩基のスパーサーで挟まれている。

(b) ヒトIgH、IGK、IGLおよびTCR α、β、γ、δ鎖遺伝子におけるRSSの分布。

(c) V(D)J再結合のメカニズム。

RAG1とRAG2の相違点

RAG1とRAG2の機能的相違点は何か。赤松氏の実験によれば、RSSおよび非特異的DNA配列を用いた場合、RAG-1のRSSへの結合親和性は非特異的DNA配列に対する結合と比較して3〜5倍程度にしか向上しなかった。一方、RAG-2については、実験的にDNAへの結合が観察されなかった。しかし、RAG1とRAG2が共存する場合、両者はDNAと結合するRAG1/2複合体を形成し、RAG1-DNA複合体よりも安定性および特異性が高く、V(D)J再結合における切断活性を示す。この結果から、RAG2はRAG1によるDNA認識を支援する役割を果たしており、RSSの効率的な結合および認識にはRAG1とRAG2の同時存在が不可欠であることが示唆される[2]。

まとめ

RAG-1およびRAG-2再結合酵素は、T細胞およびB細胞の発達および成熟、ならびに免疫グロブリン産生において不可欠な役割を果たす。V(D)J再結合において、RAG1/2複合体はRSSの認識および切断に関与する。したがって、PrkdcSCID遺伝子変異を持つマウスとは異なり、Rag1およびRag2ノックアウト（KO）マウスはV(D)J再結合経路が障害され、機能的なT細胞およびB細胞、ならびに免疫グロブリンが欠如しており、「漏れ（leakiness）」を示さない。免疫漏れの発生頻度は、SCIDマウスの遺伝的背景によって異なる。一般的に、C57BL/6JおよびBALB/c背景では高い漏れ率を示すが、C3H背景では低く、NOD背景では極めて低い。ただし、免疫漏れを引き起こす分子機構については、現在までに明らかになっていない。

Ragノックアウトマウスは代表的な免疫不全マウスモデルの一つであり、ヒト細胞やヒト組織の生着を目的とした人源化マウスの宿主としても広く利用されています。

Rag1およびRag2を含む各種モデルについては、遺伝子ノックアウトマウス作製サービスをご覧ください。また、ノックアウトマウスの一般的な作製技術については、ノックアウトマウスの作製方法をご参照ください。

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参考文献

[1] Nishana, M., & Raghavan, S. C. (2012). Role of recombination activating genes in the generation of antigen receptor diversity and beyond. Immunology, 137(4), 271–281.

[2] Akamatsu Y, Oettinger MA. (1998). Distinct roles of RAG1 and RAG2 in binding the V(D)J recombination signal sequences. Mol Cell Biol, 18(8):4670-8.