コンディショナルノックインマウスをどう同定するか？
目次
01 F1世代floxマウスのターゲットが正しいか検証する 02 floxマウスの遺伝子型の同定 03 Creマウスの削除効率を同定するF1世代floxマウスのターゲットが正しいか検証する
01 プライマーの設計
F1/R1は5'armターゲットの正確性を検証し、F2/R2は3'armターゲットの正確性を検証し、F4/R4は挿入区域を検証する。陽性と同定されたマウスが引き続きSouthern Blot検証を行う。
02 予想される断片サイズ
ストリップ1のサイズ：F1/R1の拡大した5'arm末端であり、野生型の骨組み区域＋相同腕＋loxP+ノックイン区域が含まれる。
ストリップ2のサイズ：F2/R2の拡大した3'arm末端であり、野生型の骨組み区域＋相同腕＋loxP+ノックイン区域が含まれる。
ストリップ3のサイズ：F4/R4の拡大した挿入断片である。
コメント：ストリップ1とストriップ2は相同腕骨組み区域の検証で、サイズは通常2kb以上で拡大しにくい。
03 電気泳動の結果
電気泳動を行った後で同時にストリップ1、ストリップ2、ストリップ3があるなら、陽性floxマウスと判断する。
目的ストリップが出ないなら、陰性マウス（野生型或いは他の突然変異）と判断する。
04 シークエンシング
PCR同定の以外、産物のシークエンシングも必要である。F1/R1の拡大産物のシークエンシングプライマーはloxP部位に近い5’arm（図示F3）に設定する。F2/R2の拡大産物のシークエンシングプライマーはloxP部位に近い3’arm（図示F4）に設定する。
floxマウスの遺伝子型の同定
01 プライマーの設計
F1世代マウスは出荷する時に既に相同腕ターゲットの正確性を検証された。1kb以下の目的断片を検証すればいい。通常特異性のよいloxPの辺りに設計する。
02 予想される断片サイズ
ストリップ1のサイズ：F5/R5の拡大した5'arm末端であり、野生型である。
ストリップ2のサイズ：F6/R6の拡大した5'arm末端であり、相同腕＋loxP+ノックイン区域である。
03 電気泳動の結果
電気泳動を行った後でストリップ1だけあるなら、野生マウス（+/+）と判断する。
電気泳動を行った後でストリップ2だけあるなら、陽性ホモマウス（flox/flox）と判断する。
電気泳動を行った後でストリップ1とストリップ2があるなら、陽性ヘテロマウス（flox/-）と判断する。
Creマウスの削除効率を同定する
01 プライマーの設計
5'armと3'armにプライマーを設計する。cKI区域の上流・下流に位置する。
02 予想される断片サイズ
ストリップ1のサイズ：F6/R7の拡大したターゲットベクター断片のサイズである。
ストリップ2のサイズ：F6/R7の拡大した削除後の断片のサイズである。
ストリップ3のサイズ：F6/R6の拡大した5'arm末端であり、相同腕＋loxP+一部のノックイン区域である。
ストリップ4のサイズ：F5/R5の拡大した5'arm末端であり、野生型である。
コメント：F6/R7は断片が多すぎるか、またはゲノムの精製効果が悪いため、ストリップが出ない可能性がある。
03 電気泳動の結果
電気泳動を行った後でストリップ2だけあるなら、cKIホモマウス（二つの染色体とも削除が発生した）と判断する。
電気泳動を行った後でストリップ2とストリップ4があるなら、cKIヘテロマウス（1つの染色体が削除が発生した）と判断する。
電気泳動を行った後でストリップ1或いはストリップ3があるなら、Cre削除効率が低いか、またはloxpの間の区域で削除が発生しなかったかもしれない。
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