コンディショナルノックインマウスをどう同定するか？

F1世代floxマウスのターゲットが正しいか検証する

01 プライマーの設計

F1/R1は5'armターゲットの正確性を検証し、F2/R2は3'armターゲットの正確性を検証し、F4/R4は挿入区域を検証する。陽性と同定されたマウスが引き続きSouthern Blot検証を行う。

02 予想される断片サイズ

ストリップ1のサイズ：F1/R1の拡大した5'arm末端であり、野生型の骨組み区域＋相同腕＋loxP+ノックイン区域が含まれる。

ストリップ2のサイズ：F2/R2の拡大した3'arm末端であり、野生型の骨組み区域＋相同腕＋loxP+ノックイン区域が含まれる。

ストリップ3のサイズ：F4/R4の拡大した挿入断片である。

コメント：ストリップ1とストriップ2は相同腕骨組み区域の検証で、サイズは通常2kb以上で拡大しにくい。

5'アーム・3'アームを用いた相同組換えや、Southern blotによるターゲット検証などのES細胞ターゲティング技術については、ES細胞ターゲティング技術の詳細ページをご参照ください。

03 電気泳動の結果

電気泳動を行った後で同時にストリップ1、ストリップ2、ストリップ3があるなら、陽性floxマウスと判断する。

目的ストリップが出ないなら、陰性マウス（野生型或いは他の突然変異）と判断する。

04 シークエンシング

PCR同定の以外、産物のシークエンシングも必要である。F1/R1の拡大産物のシークエンシングプライマーはloxP部位に近い5’arm（図示F3）に設定する。F2/R2の拡大産物のシークエンシングプライマーはloxP部位に近い3’arm（図示F4）に設定する。

floxマウスの遺伝子型の同定

01 プライマーの設計

F1世代マウスは出荷する時に既に相同腕ターゲットの正確性を検証された。1kb以下の目的断片を検証すればいい。通常特異性のよいloxPの辺りに設計する。

02 予想される断片サイズ

ストリップ1のサイズ：F5/R5の拡大した5'arm末端であり、野生型である。

ストリップ2のサイズ：F6/R6の拡大した5'arm末端であり、相同腕＋loxP+ノックイン区域である。

03 電気泳動の結果

電気泳動を行った後でストリップ1だけあるなら、野生マウス（+/+）と判断する。

電気泳動を行った後でストリップ2だけあるなら、陽性ホモマウス（flox/flox）と判断する。

電気泳動を行った後でストリップ1とストリップ2があるなら、陽性ヘテロマウス（flox/-）と判断する。

Creマウスの削除効率を同定する

01 プライマーの設計

5'armと3'armにプライマーを設計する。cKI区域の上流・下流に位置する。

02 予想される断片サイズ

ストリップ1のサイズ：F6/R7の拡大したターゲットベクター断片のサイズである。

ストリップ2のサイズ：F6/R7の拡大した削除後の断片のサイズである。

ストリップ3のサイズ：F6/R6の拡大した5'arm末端であり、相同腕＋loxP+一部のノックイン区域である。

ストリップ4のサイズ：F5/R5の拡大した5'arm末端であり、野生型である。

コメント：F6/R7は断片が多すぎるか、またはゲノムの精製効果が悪いため、ストリップが出ない可能性がある。

03 電気泳動の結果

電気泳動を行った後でストリップ2だけあるなら、cKIホモマウス（二つの染色体とも削除が発生した）と判断する。

電気泳動を行った後でストリップ2とストリップ4があるなら、cKIヘテロマウス（1つの染色体が削除が発生した）と判断する。

電気泳動を行った後でストリップ1或いはストリップ3があるなら、Cre削除効率が低いか、またはloxpの間の区域で削除が発生しなかったかもしれない。