Cre-Lox再結合システムについて
1. Cre-Loxシステムとは？
Cre-Loxシステムには主に2つの要素が存在し、いずれもP1バクテリオファージ由来である。
Creレコビナーゼ
サイクル化レコビナーゼ（Cre）は、チロシン系サイト特異的レコビナーゼの一種であり、2つのDNA認識配列（LoxP配列）間でサイト特異的再結合を触媒する。Creレコビナーゼは343アミノ酸から構成され、Lox配列を特異的に認識する。Cre以外にも、フリッパーゼ（Flp）やD6特異的レコビナーゼ（Dre）が存在するが、これらの酵素はCreに比べ再結合効率が低く、実用性に制限がある。
LoxP配列
Creレコビナーゼが認識する反復配列は、LoxP（locus of X-over P1）配列と呼ばれる。LoxP配列は、13bpの逆相補配列が両端にあり、中央に8bpのスパーサー領域（再結合が起こる部位）を持つ、方向性を有する34bpの対称配列である。LoxP配列の向きによって、3種類の遺伝子再結合が生じる：除去、逆位、転座。野生型LoxP配列に加えて、Lox2272、Lox511、Lox5171など、変異型Lox配列も存在する。これらの変異型Lox配列もCreレコビナーゼによって認識可能であるが、再結合は同じ種類の変異Lox配列同士でのみ可能である。
表1. 公開された変異型LoxP配列
| LoxP配列 | 左反復配列 | スパーサー（5'→3'） | 右反復配列 |
|---|---|---|---|
| 野生型 | ATAACTTCGTATA | ATGTATGC | TATACGAAGTTAT |
| Lox511 [6] | ATAACTTCGTATA | ATGTATaC | TATACGAAGTTAT |
| Lox5171 [7] | ATAACTTCGTATA | ATGTgTaC | TATACGAAGTTAT |
| Lox2272 [7] | ATAACTTCGTATA | AaGTATcC | TATACGAAGTTAT |
| m2 [8] | ATAACTTCGTATA | AgaaAcca | TATACGAAGTTAT |
| m3 [8] | ATAACTTCGTATA | taaTAcca | TATACGAAGTTAT |
| m7 [8] | ATAACTTCGTATA | AgaTAgaa | TATACGAAGTTAT |
| m11 [8] | ATAACTTCGTATA | cgaTAcca | TATACGAAGTTAT |
| Lox71 [12, 13] | taccgTTCGTATA | ATGTATGC | TATACGAAGTTAT |
| Lox66 [12, 13] | ATAACTTCGTATA | ATGTATGC | TATACGAAcggta |
2. Cre-Loxを用いた条件的モデルの開発
恒常的に発現する遺伝子変異と比較して、条件的モデルは遺伝子発現の時間的・空間的制御をより高精度で実現できる。Cre-Lox再結合システムは、組織特異的または誘導型ノックアウトを、空間的・時間的発現制御の高いレベルで実現可能にする。
図1. Cre-LoxPシステムのメカニズム
(A) Cre-LoxPシステムの概要。38 kDaのCreレコビナーゼが特定の34 bp DNA配列（LoxP配列）を認識し、その配列を切除して遺伝子Yを不活性化する。(B) ロックスP配列とCre駆動マウス系を用いた条件的突然変異の一般的な交配戦略。組織特異的Cre駆動系と遺伝子Yのフロックスアレルを交配させることで、プロモーターXに関連する組織で遺伝子Yが不活性化される。
マウスおよびラットモデルにおけるターゲット遺伝子編集能力：
図1に示すように、基本的なCre-loxP再結合イベントは、遺伝子配列の制御下での除去に最も広く用いられている。この技術は、Cre依存性の遺伝子ノックアウト（KO）モデル（図1に示す）や、以下に述べるトランスジェン・スイッチ戦略によるCre依存性遺伝子発現モデルの構築に応用されている。
- 標準的用途 - 組織特異的または誘導型ノックアウト（例：Cre依存性配列KO）の生成、例えばKO-first条件的アレル戦略
-
トランスジェン・スイッチ –（Cre依存性遺伝子発現）
- トランスジェンの活性化： プロモーターとコード領域の間にloxP配列で囲まれた「ストップ」配列が存在し、Cre株と交配するまで発現がブロックされる。
- 誘導型ノックアウト（KO）： loxP配列で囲まれたトランスジェン配列は、Cre株と交配することで除去される。
- レポーター株 - loxP配列で囲まれた蛍光タンパク質配列を用いて、Creレコビナーゼの活性部位を視覚的に確認可能
Cyagen Creモデルプラットフォーム
Cre-Loxモデル戦略の有用性は認められているが、交配プロトコルの複雑さとラットコロニー維持に伴うコスト増加が、新たな条件的ラットモデルの開発を希望する研究者にとって大きな障壁となっている。また、cKOやcKIラットモデルの開発において、研究対象の組織・細胞に特異的なCre株が不足しているという課題も存在する。
カスタムラットモデルのリーディング企業として、CyagenはCre-loxPモデルリソースのリポジトリを構築しており、Cre駆動ラット株を含む各種リソースを提供している。研究者に世界中で利用可能な、ヒト疾患の生理的・病態的に意味のあるモデルを構築するための、完全なカスタム条件的ノックアウト（cKO）または条件的ノックイン（cKI）ラットモデルと、それに必要なCre駆動株を提供している。
現在開発中の一部のCreラット株：
| alb (Cre Ert2) | myh6 (Cre Ert2) | slc6a3 (Cre Ert2) | camk2a (Cre Ert2) | nphs2 (Cre Ert2) |
| alb (Cre) | myh6 (Cre) | slc6a3 (Cre) | camk2a (Cre) | nphs2 (Cre) |
| gfap (Cre) | gfap (Cre Ert2) | nes (Cre) | nes (Cre Ert2) |
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Cyagenについて
Cyagenは、遺伝子研究およびモデル作成のニーズに応じた「ワンストップショップ」を提供しています。DNAベクター構築から胚性幹細胞操作、マイクロインジェクション、交配まで、あらゆる工程をカスタマイズ可能で柔軟に対応しています。
- AAALAC認定・OLAW認証動物施設
- 特異病原体フリー（SPF）の動物健康状態。多くの施設の要件を上回る水準
- 50,400以上のマウスおよびラットモデルを世界中に提供
- Nature、Immunityなど、高インパクトジャーナルで4,000件以上の論文に引用
- トップクラスのカスタマーサポート：無料のコンサルティングおよび見積もり対応
- 100％返金保証
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参考文献：
- Kim H, Kim M, Im SK, Fang S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Lab Anim Res. 2018;34(4):147-159. DOI:10.5625/lar.2018.34.4.147
- Missirlis PI, Smailus DE, Holt RA. A high-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics of the loxP spacer region in Cre-mediated recombination. BMC Genomics. 2006;7:73. Published 2006 Apr 4. DOI:10.1186/1471-2164-7-73
