誘導型Creマウスによる膵臓遺伝子ノックアウトの高度化
Cre-Loxシステムは、特定の細胞・組織における遺伝子ノックアウト／ノックインを可能にする。その発現タイミングはプロモーターによって制御される。さらに時間的・空間的制御を両立させるために、リガンド依存性のCreER再結合酵素が開発された。CreERは、Cre再結合酵素とエストロゲン受容体のホルモン結合ドメインを融合させたものである。エストロゲンアナログであるタモキシフェンが存在しない状態では、再結合酵素は主に細胞質に存在する。タモキシフェンの作用下でのみ、核内に移行し再結合活性を発揮する。CreERT2は、エストロゲン結合ドメインに3つのアミノ酸置換（G400V/M543A/L544A）を導入した改良型で、非誘導状態での背景活性を低減するとともに、タモキシフェン感受性および誘導効率を向上させている。本日は、改良された膵臓特異的Creドライバーマウスライン——Pdx1-CreERT2マウスモデル（製品番号：C001537）——をご紹介する。
PDX1遺伝子：膵臓形成とβ細胞機能の鍵
PDX1遺伝子は、膵臓形成、β細胞の成熟および維持、および正常なインスリン機能を制御する主要な調節因子である。PDX1遺伝子の活性化はインスリン分泌およびβ細胞における重要な遺伝子の発現を促進し、膵幹細胞がβ細胞へ分化する上で不可欠である。したがって、PDX1は糖尿病に対する遺伝子治療や細胞置換療法の重要な標的となる。[1]
研究により、PDX1タンパク質はα細胞の分化を抑制することでβ細胞の特徴および機能を維持しており、PDX1が欠損してもβ細胞は生存可能であり、β細胞からα細胞への再プログラミングが進行することが示されている。[2] PDX1は早期の膵上皮において特異的に発現し、発生過程における増殖および分化に機能する。成体においては、β細胞におけるホルモン産生に不可欠である。PDX1は膵臓発生初期に最も早く発現する転写因子の一つであり、β細胞の成熟過程でも継続的に発現している。[1,3] さらに、β細胞および一部のδ細胞に加えて、発生過程においては消化管（十二指腸など）および中枢神経系でも発現している。[4-5]
Pdx1-CreERT2マウスモデルによる膵臓特異的遺伝子研究
Cyagenは、遺伝子編集技術を用いて独自に開発したPdx1-CreERT2マウス（製品番号：C001537）を提供しており、遺伝子研究および臨床前研究における優れた時間的制御を実現する膵臓特異的Creドライバー株である。Pdx1-CreERT2マウスは、マウスPdx1遺伝子の調節領域下でCreERT2再結合酵素を発現させている。Pdx1-CreERT2マウスをloxP配列を含むマウスと交配させた後、タモキシフェンの投与により、後代の膵臓細胞においてCre再結合酵素によるloxP配列間の再結合を誘導できる。
タモキシフェン誘導による膵臓組織特異的遺伝子再結合
タモキシフェン投与なしでは、CreERT2再結合酵素は主に細胞質に存在する。タモキシフェン投与によりのみ、CreERT2再結合酵素が核内に移行し、再結合活性を発揮する。Pdx1-CreERT2マウスをloxP配列を有するマウスと交配させ、後代にタモキシフェンを投与することで、Cre再結合酵素がloxP配列間の再結合を介して膵臓細胞で遺伝子改変を誘導できる。なお、タモキシフェン投与なしでは、誘導前の段階でCreERT2再結合酵素の漏れ発現が生じる可能性がある。本株におけるCre再結合酵素遺伝子発現カセットの挿入部位は染色体5に位置しているため、同染色体上に遺伝子編集対象があるマウスと交配する場合には注意が必要である。
Pdx1-CreERT2マウスはPdx1-Creマウスよりも膵臓特異的な再結合効率が高い
Pdx1-CreERT2マウスをROSA26-LSL-tdTomatoマウスと交配させ、タモキシフェンまたはコーンオイルで誘導することで、二重転写子の後代におけるCreERT2再結合酵素の発現を確認した。蛍光顕微鏡による結果では、タモキシフェン投与群において膵臓に顕著なtdTomato蛍光信号が観察され、高い再結合活性が示された。また、非誘導型のPdx1-Creマウスと比較して、Pdx1-CreERT2マウスは膵臓における再結合効率が顕著に高いことが確認された。
Cre再結合酵素は十二指腸および胸腺に限定的に発現する
Pdx1-CreERT2マウスモデルは良好な組織特異性を示す
まとめ
Pdx1-CreERT2マウスモデル（製品番号：C001537）は、膵臓において高いCre再結合酵素の発現を示し、十二指腸および胸腺では部分的な蛍光信号が観察されたことから、微小な再結合イベントが生じる可能性がある。一方、胃、子宮、卵巣、肺、肝臓、脳組織では、タモキシフェン投与群およびコーンオイル投与群のいずれにおいても再結合信号は検出されなかった。これは、他の主要組織への標的外発現が抑制されており、膵島細胞組織に対する標的遺伝子研究に適した良好な特異性を有していることを示している。
参考文献
[1] Ebrahim N, Shakirova K, Dashinimaev E. PDX1 is the cornerstone of pancreatic β-cell functions and identity. Front Mol Biosci. 2022 Dec 15;9:1091757.
[2] Gao T, McKenna B, Li C, Reichert M, Nguyen J, Singh T, Yang C, Pannikar A, Doliba N, Zhang T, Stoffers DA, Edlund H, Matschinsky F, Stein R, Stanger BZ. Pdx1 maintains β cell identity and function by repressing an α cell program. Cell Metab. 2014 Feb 4;19(2):259-71.
[3] Jennings RE, Berry AA, Kirkwood-Wilson R, Roberts NA, Hearn T, Salisbury RJ, Blaylock J, Piper Hanley K, Hanley NA. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 2013 Oct;62(10):3514-22.
[4] Ma J, Chen M, Wang J, Xia HH, Zhu S, Liang Y, Gu Q, Qiao L, Dai Y, Zou B, Li Z, Zhang Y, Lan H, Wong BC. Pancreatic duodenal homeobox-1 (PDX1) functions as a tumor suppressor in gastric cancer. Carcinogenesis. 2008 Jul;29(7):1327-33.
[5] Perez-Villamil B, Schwartz PT, Vallejo M. The pancreatic homeodomain transcription factor IDX1/IPF1 is expressed in neural cells during brain development. Endocrinology. 1999 Aug;140(8):3857-60.
