遺伝子改変ラット・マウスを初期段階の際に、各種の遺伝子改変マウスの作製技術と原理について疑問を抱いていますか？ES細胞ターゲティング技術とCRISPR/Cas9技術のどっちが優れていますか？更にどのようにニーズに応じて適切な遺伝子改変ラット・マウスを選択するか？今回のオンライン講座で、サイヤジェン株式会社の日本エリア専門家Dr. 姚　錦春（ヨウ　キンシュン）（関西医科大学出身の腫瘍ウイルス学）が、遺伝子改変ラット・マウスの技術発展過程及びモデル作製方法について説明します。

お客様からのあつい信頼を頂いている事が感じ取れました。今回のセミナー内容をもっと深く理解できるようにするために、サイヤジェンは特別にQ&Aを用意いたしました。

1. CRISPR Cas9はES ターゲティングの代わりになる可能でしょうか？

近年CRISPR Cas9は急速に発展することになり、広く使用されています。将来Crispr-cas9はES ターゲティングの代わりになるかも知れませんが、今では、大きなフラグメントと複雑なケースなら、ES ターゲティング技術に優位性があります。CRISPR Cas9 にはオフターゲットの可能性があり、まだ限界があります。高品質のモデル必要なら、ES ターゲティングがおすすめです。

2. 遺伝子発現の検証方法について教えてください。

遺伝子発現の検証方法三つがあります。

• DNAレベル：  RT-PCR、Sequencing、Southern
• RNAレベル： RT-PCR、sequencing
• タンパク質レベル：Western bolt、IHC（免疫組織染色）、IF（免疫蛍光染色）

3. 遺伝子改変マウスの購入する場合、Cre酵素の作動性など、その遺伝子改変マウスのvalidationは行われているのでしょうか？それとも納品されてからやってみないと分からないというようなものでしょうか。

サイヤジェンの遺伝子改変マウスモデルで、出産されたF0マウスはノックアウト遺伝ができるかどうかを確認するため、お客様に繁殖後のDNAレベルのPCRとSequencingを検証したF1マウスを渡します。

必要なら、RNAレベルのPCRとか、タンパク質レベルのwesternとかの検証も可能です、別の料金がかかります。

でもノックアウトマウスの結果はCreマウスの選択に関連します。交配させた後、そのマウスのgenotypeを検証できます。

4. サイヤジェンはES ターゲティング技術に使用されるマウス系統は？

サイヤジェンはES ターゲティングならC57BL6Jと C57BL6N 系統で、ラットならSD系統で使っています。

5. なぜマウスモデルが多く、ラットが少ないのか？

ラットはマウスに比べて性成熟や妊娠のサイクルが長いため、コストを抑えて早く結果を出したい場合は、マウスが良いでしょう。

ラットはマウスに比べて体が大きいので解剖しやすく、心血管や神経系のモデルによく使われます。

サイヤジェンはラットモデル製作に10年以上の経験を持っています。もしお手伝いが必要なら、いつでもご連絡ください。

6. Floxマウスのサイクルと成功率を教えてください。

サイヤジェンCRISPR PROの場合5-6ヶ月になります。 ヘテロマウス陽性は30%ぐらいで得られます。

サイヤジェンTurbo  ES ターゲティング なら6-8ヶ月になります。 ヘテロマウスは陽性100%ぐらいで得られます。

7. ツールマウスをどうやって選択する？

ツールマウスを選択するのは非常に重要です、ツールマウスを使う前にその背景がはっきりと分かるように調べてください。MGIに登録されているさまざまな実験条件で得られたマウスの遺伝子発現情報を閲覧できます。

8. 陽性クローンというのはヘテロですか？

はい、陽性クローンというのはヘテロマウスです。

9. ホモロジーアームのサイズはどれくらいですか？

ES ターゲティングは一般的に両端合わせて6～7kbpで、長さは効率に関係し、長ければ長いほど安全です。

ROSA26の相同性アームが1.4kb、もう一方が4kbp。

Crispr-Cas9の場合、通常は1kまたは2kである。

これも遺伝子の特性に関係するもので、事前に遺伝子の情報を確認する必要があります。

10. ある遺伝子はマウスとヒトは相同性が高くないことが判明しましたが、マウスモデルを使う意義は何でしょうか？ 

一般的に60-70%の相同性があれば、マウスモデルに十分な説得力がある。50％以下であれば、検討の余地があるかもしれません。

11. トランスジェニックマウスの遺伝子型判定primerのデザインについて？

一般的にトランスジェニックマウスは発現させたい標的遺伝子と蛍光タンパクの

共同発現ケースが多い、そしてランダム挿入ですので、導入遺伝子内部によって発現標的遺伝子と蛍光発現遺伝子の結合部位両端にプライマーをデザインして、BAC法であれば、BACフラグメントが大きすぎて壊れやすいので、整合性を確認するために標的遺伝子10kpbの間隔ぐらいでプライマーをデザインしたほうが安心です。

12. リアルタイムPCRに最適なプライマーセットのデザイン？

導入遺伝子のゲノム挿入位置を跨ぐようなプライマーを３つ使用出来ます、5'側、 3'側、両側というように、プライマーセットのデザインをしたほうがいいです。

PCR産物の長さと組み合わせで導入遺伝子についてホモ型(+/+)・ヘテロ型(+/-)・野生型(-/-)を判定するというものである。

今回のセミナーは多くの内容が含まれ、少しでもお役に立てば光栄です。お客様がチェックと回顧できるようにするために、完全なセミナー動画を提供致します。

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サイヤジェン株式会社について

サイヤジェン株式会社は15年間の発展を経て、全世界の数万人の科学研究者にサービスを提供しており、製品と技術は直接にCNS (Cell、Nature、Science)の定期刊を含む5,200余りの学術論文に応用されています。弊社の「ノックアウトマウスライブラリ」は低価格だけでなく、遺伝子名称を入力すれば、ワンクリックで注文まで操作できます。 ノックアウトマウス、ノックインマウス、コンディショナルノックアウトマウス、トランスジェニックマウス、GFPマウス、免疫不全マウス、無菌マウスなどのカスタマイズサービスを提供する以外、専門的な手術疾患モデルチームがあり、多種の複雑な小動物手術疾患モデルも提供できます。