＜GUT＞論文解釈：CPA1突然変異はどのように慢性膵炎をを引き起こすのか？

慢性膵炎とCPA1遺伝子変異

慢性膵炎は、さまざまな原因により膵臓の組織と機能に不可逆的な変化を引き起こす慢性炎症性疾患である。その発症は通常、消化酵素またはそれらの阻害剤に関連する遺伝的要因によって決定される。PRSS1、SPINK1、およびCTRCなどの遺伝子の変異は、トリプシンレベルと膵炎リスクを変化させる。

重要なことに、慢性膵炎の遺伝的リスクは、トリプシン活性とは無関係のメカニズムによっても媒介される可能性がある。例えば、いくつかのPRSS1変異はトリプシン活性に影響を及ぼさないが、酵素のミスフォールディングを引き起こし、ERストレスを引き起こす。同様に、CPA1突然変異もまた体外で酵素ミスフォールディングを引き起こし、細胞滞在、分解およびERストレスをもたらす。

in vitroで観察された結果は突然変異によるミスフォールディングおよびERストレスを支持しているが、適切な動物モデルの証拠はなく、CPA1突然変異の病因も仮定されている。これは疾患メカニズムの研究を制限し、また新しい治療法の前臨床試験を妨げる。

CPA1 N256Kノックインマウスの開発

米国のボストン大学の研究者らは、マウスCpa1遺伝子座にヒトCPA1p.N256K変異を有する新規ノックインマウス系統を確立した。また、このマウス系統の研究を通して、彼らはCPA1変異が酵素ミスフォールディングを引き起こし、ERストレスのメカニズムを通して慢性膵炎を引き起こすことを確認しました。この重要な結果は、消化管のトップジャーナル＜Gut＞に掲載されました。

この研究の意義は、これが消化酵素のミスフォールディングおよびERストレスに関わる慢性膵炎の最初のマウスモデルであるということである。慢性膵炎の発症と進行に対するさまざまな環境要因（アルコール、喫煙、高脂肪食など）または薬物の影響をテストするのに特に適している。

この研究では、ボストン大学のMiklós Sahin-TóthとEszter Hegyiが、遺伝子ターゲティングによるCPA1変異ノックインマウスCyagen に依頼した。同時に、CPA1　null系統も作製した。ネオマイシン（neo）発現カセットの存在がCpa1 mRNAおよびCPA1タンパク質発現のレベルの低下をもたらしたので、この系統は、CPA1タンパク質活性の喪失とCPA1のミスフォールディングとを区別するための対照として役立つ。

研究者らは、CPA1 N256KおよびCPA1 Null マウスの膵臓におけるCpa1 mRNAの発現を同定するために、1ヶ月齢の動物から膵臓cDNAを調製した。定量的PCR分析は、CPA1 N256KのCPA1 mRNA発現がC57BL/6Nコントロールと比較して30%減少した一方、CPA1　Nullは95%減少したことを示した。ウエスタンブロット分析はまた、CPA1 N256KのCPA1タンパク質含有量は減少したが依然として有意であることを示したが、CPA1 NullはCPA1タンパク質の発現を検出できなかった。

mRNAおよびタンパク質発現の変化

図1 CPA1 N256Kマウス作製および突然変異体対立遺伝子の発現。

CPA1 N256KおよびCPA1 Nullマウスの膵臓におけるCpa1 mRNAおよびCPA1タンパク質の発現量を定量的に評価した結果、N256K変異は発現を部分的に低下させるが完全には消失させないことが示された。これにより、変異の生化学的影響を正確に解析できる。

CPA1変異タンパク質の細胞内保持

その後、彼らは、6週齢のCPA1 N256KおよびC57BL/6Nコントロールマウスから膵臓腺房細胞を単離し、培地へのCPA1の分泌を測定した。CPA1 p.N256K変異体の分泌は、野生型CPA1タンパク質と比較してほとんど検出されなかった。一方、腺房細胞溶解物のウエスタンブロット分析は、高レベルのCPA1変異タンパクを示して、これは、変異タンパク質が細胞内に保持されていることを示している。

同時に、彼らはまた、N256K株の細胞内CPA1タンパク質レベルがコントロールよりわずかに低いことを観察でき、これはいくつかのミスフォールディングおよび保持された変異タンパク質が分解されたことを示している。

図2 CPA1 N256KおよびC57BL/6Nコントロールマウスの腺房細胞によって分泌されたCPA1タンパク質（自発的またはセルレイン誘導）。

変異体の分泌不全と細胞内への保持は、ERストレスの誘導と密接に関連している。

慢性膵炎の病理的兆候の確認

研究者らは、2つの新しいCPA1系統のいずれも有意な表現型の変化とともに正常な生殖が可能であることを見出した。CPA1 nullマウスおよびC57BL/6Nコントロールマウスの膵臓形態は類似していた。一方、CPA1 N256Kマウスは3ヶ月齢以降小さい膵臓を有することが観察された。重量分析は、CPA1 N256K系統の膵臓の萎縮を確認した。

膵臓萎縮の組織学的変化を確認するために、彼らは1、3、6および12ヶ月齢のマウスの膵臓切片を染色し、それらを対応するCPA1 null切片およびC57BL/6N切片と比較した。CPA1 N256K変異マウスについて、研究者らは、腺房細胞萎縮および炎症細胞浸潤を含む慢性膵炎の徴候を観察した。

この結論は、CPA1 N256Kマウスの腺房における広範囲の線維症を明らかにしたマッソン三色染色によってさらに確認された。彼らはまた、サイトケラチン19およびSox9の免疫組織化学的染色によって腺房 - カテーテル化生を観察した。一方、CPA1 nullでは、C57BL/6Nコントロールマウスと同様に、膵臓疾患の徴候を示さなかった。

図3 CPA1 N256Kマウスの線維症および腺房カテーテル異形成。

これらの病理学的変化は、ミスフォールドしたCPA1タンパク質が慢性的な損傷を引き起こすことを示唆している。

ERストレスマーカーの発現上昇

最後に、CPA1 N256K系統の組織学的変化がERストレスマーカーの上昇と関連しているかどうかを決定するために、研究者らは、マウスのシャペロンタンパク質Hspa5（BiP）と転写因子Ddit3（CHOP）をそれぞれ1ヶ月、3ヶ月、12ヶ月で測定した。CPA1 N256KマウスにおけるBiPは、C57BL/6NおよびCPA1 nullコントロールと比較して一貫性があるが中程度の上方制御を示したが、CHOPはすべての時点で有意な上方制御を示した。

図4 CPA1 N256Kマウス、CPA1 nullマウス、およびC57BL/6Nコントロールマウスにおける小胞体ストレスマーカーHspa5およびDdit3の発現。

CHOPの持続的な発現上昇は、ERストレスがアポトーシス経路を介して腺房細胞の死を誘導している可能性を示している。

前臨床モデルとしての有用性

CPA1 N256Kノックインマウスに関する一連の実験は、CPA1突然変異p.N256Kが酵素をミスフォールドさせ、そしてERストレスに関連するプロアポトーシス転写因子CHOPのアップレギュレーションを伴う慢性膵炎を引き起こすことを示した。これらの病理学的現象はCPA1 nullマウスでは観察されず、CPA1 機能の喪失それ自体が腺房細胞損傷を引き起こさないことを示している。ミスフォールド依存性経路は、慢性膵炎においても病原性の役割を果たしており、これはまた、ERストレス関連メカニズムを標的とする治療的介入のための基礎を築く。

研究者らは、ミスフォールディングによって引き起こされる慢性膵炎のこの新しいモデルが前臨床試験において役割を果たすと予想されることを強調している。CPA1 N256Kマウス系統は正常に発生しそして繁殖する。これらの特性は、膵臓病変のスケジュールとともに、さまざまな環境損傷（アルコール、喫煙、高脂肪食）や慢性膵炎の治療薬をテストするための理想的なモデルになる。

原文
Gut 2018;0:1–12. doi:10.1136/gutjnl-2018-315994

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