「文献精読」Diabetes - ZnT8ノックアウトマウスにおける脂質代謝

ZnT8ノックアウトマウスと脂質代謝

胃腸管組織には最も多くの内分泌細胞が含まれており、多くの胃腸ホルモンがブドウ糖および脂質の恒常性に重要な役割を果たしています。5-hydroxytryptamine（5-HT、セロトニン）は、中枢および末梢機能を発揮する最も一般的な胃腸ホルモンです。5-HTの90％以上が腸クロム親和性細胞によって合成され、放出されます。Tryptophan hydroxylase（TPH、トリプトファンヒドロキシラーゼ）は、5-HTの初期合成と律速のための重要な触媒酵素です。最近の研究では、末梢5-HTが白色脂肪組織の脂肪生成を促進し、褐色脂肪組織の適応性熱産生を阻害できることが示されています。マウスでは、遺伝子サイレンシングまたは5-HT合成の重要な酵素TPH1に対する薬物阻害により、マウスが食餌誘発性肥満および耐糖能障害に耐性を示すことができます。これは、末梢の5-HTが脂質代謝と全身のエネルギーバランスの重要な調節因子であることを示唆しています。

ZnT8は、膵臓のβ細胞で豊富な亜鉛トランスポーターであり、1型および2型糖尿病の発症と密接に関連しています。ただし、システムのエネルギー代謝におけるZnT8の確実な役割およびその作用機序はまだよくわかっていません。19年にDiabetesで発表された研究は、ZnT8遺伝子ノックアウトマウスを構築することで、マウス体内の脂質代謝を調節するZnT8のメカニズムを調査しました。著者は、マウスでZnT8ノックアウトによって誘発される脂質蓄積を最初に発見し、マウスの血液と組織において一連の生化学的検査および免疫染色を通じて、ZnT8/TPH1/5-HT調節軸を発見しました。さらに、細胞実験では、siRNAによるZnT8のノックダウンによって動物実験の結果を検証し、そして、ZnT8が細胞内亜鉛イオン濃度を調節することによって下流経路の変化に影響を与える可能性があることを発見しました。この記事から、私たちは代謝研究におけるノックアウトマウスの利点を理解することができます。細胞実験では、さまざまな器官や末梢循環の代謝変化を観察できないため、この利点は従来の細胞実験では比類のないものであり、より説得力があります。

表現型1：ZnT8ノックアウトマウスは脂肪の増加を示しました

まず、著者はTALEN技術によってC57BL/6NマウスでZnT8タンパク質をコードするSlc30a8遺伝子をノックアウトしました（このZnT8ノックアウトマウスはサイヤジェンから提供されました）。ZnT8ノックアウトマウスと野生型マウスの形態および成長傾向は類似しています。しかし、雄と雌のZnT8ノックアウトマウスは、いずれも体脂肪量の増加と除脂肪量の減少を示しました。白色脂肪組織WAT（精巣上体白色脂肪組織eWATと皮下白色脂肪組織scWATを含む）も有意に増加しました。このような変化は、脂肪細胞のサイズが大きくなることによって引き起こされました。

図1. ZnT8ノックアウトは脂肪の増加につながります

表現型2：ZnT8ノックアウトマウスの肝臓における脂質およびグリコーゲン沈着の増加

肝臓は脂質代謝の重要な器官です。著者は、HE染色、オイルレッド染色およびPAS染色法により、ZnT8ノックアウトマウスの肝臓に脂質およびグリコーゲンの沈着があり、肝臓のトリアシルグリセロールのレベルが有意に増加し、総コレステロールが増加しなかったことを発見しました。上記のデータは、ZnT8の欠失が脂肪組織と肝臓での脂質の蓄積を引き起こすことを示しています。

図2. ZnT8ノックアウトは肝臓での脂質とグリコーゲンの蓄積につながります

メカニズム：ZnT8は腸内分泌細胞で発現し、末梢の5-HTレベルを調節します

胃腸管はグルコースと脂質代謝を調節する重要な器官でもあるため、著者はZnT8ノックアウトマウスの腸が著しく肥厚し、PCNA染色によって陽性染色細胞の有意な増加を発見し、ZnT8の欠失が腸細胞の増殖を促進できることが示されています。次に、著者は、ZnT8が腸で発現しているかどうか、およびその腸での局在化を免疫蛍光染色によって腸で確認しました。著者は、ZnT8は腸の上皮層に存在し、平滑筋層や固有層に存在しないことを発見しました。陽性染色細胞は三角形であり、結腸上皮細胞層内に散在します。次に、著者は、ZnT8抗体と、腸内分泌細胞のマーカーであるCgAおよび他の腸ホルモンマーカーを共染色し、ZnT8が主にCgAおよび5-HT陽性細胞に存在することを観察しました。5-HTは最も一般的な胃腸ホルモンであり、循環器系での5-HTの90％以上が腸によって合成され、分泌されます。

図3. 腸内でのZnT8の発現および局在化

ZnT8ノックアウトマウスの結腸における5-HT細胞の染色強度および数が有意に増加し、末梢血清での5-HTレベルも野生型マウスよりも有意に高いことは注目する価値があります。TPH1は末梢での5-HTの合成に関与しており、結腸でのmRNAおよびタンパク質のレベルがいずれも有意に増加しました。上記の結果は、ZnT8が腸内分泌細胞、特に5-HT陽性腸クロム親和性内分泌細胞で発現し、ZnT8の欠失が腸内のTPH1のレベルを上昇させ、それによって5-HTの合成と末梢系への分泌を促進することが可能であることを示しています。

図4. ZnT8のノックアウトは、マウスのTPH1のレベルおよび5-HTの合成と分泌を増加させます

ZnT8が5-HTレベルを調節するメカニズムをさらに調査するために、著者はRIN14B細胞をイン・ビトロ細胞実験モデルとして使用しました。RIN14B細胞はラットのδ細胞株であり、5-HT分泌を研究するための適切な細胞モデルと見なされています。著者はRIN14BでsiRNAを用いてZnT8の発現をノックダウンした後、TPH1のタンパク質レベルがほぼ3倍に増加したことを発見しました。ELISA実験は、ZnT8ノックダウン後、細胞溶解液および培地上清中の5-HTが有意に増加したことを示しました。上記のイン・ビトロ実験データは、ZnT8の欠失がTPH1の発現を増加させ、5-HTの合成を促進することを示しています。ZnT8は細胞膜を通るように亜鉛イオンを介する輸送タンパク質であるため、著者は細胞亜鉛イオンの濃度の変化がTPH1と5-HTのレベルに影響を与えるかどうかを理解したいと考えています。培地にZnSO4を添加した後、TPH1と5-HTのレベルが有意に増加しました。亜鉛イオンを除去するための亜鉛イオンキレート剤TPENを添加した後、培地上清中の5-HTの分泌には明らかな影響がありませんでしたが、TPH1のmRNAおよびタンパク質の発現が弱まりました。上記の結果は、ZnT8が細胞内亜鉛イオン濃度を調節することによってTPH1の発現に影響を与える可能性があることを示しています。

図5. ZnT8は、亜鉛イオンを調節することによってTPH1の発現に影響を与えます

まとめ

著者は、ノックアウトマウスにより、ZnT8欠失がマウス脂質代謝に対する重要な調節機能を最初に発見し、マウス体内の表現型およびメカニズムを詳しく説明した後、証拠を補足するためにイン・ビトロ細胞モデル実験を使用しました。研究全体は次のように要約できます。腸内分泌細胞におけるZnT8はTPH1の発現を調節し、それによって胃腸ホルモン5-HTの合成を調節でき、5-HTが末梢系に分泌され、最終的に全身の脂質代謝のバランスを調節します。この記事では、サイヤジェンが提供したZnT8遺伝子ノックアウトマウスの利点を最大限に活用し、脂質代謝の研究にうまく適用しています。

私たちは、ある遺伝子の調節機能を研究するとき、動物モデルおよび細胞モデルから同時に検証できれば、その調節の役割をより完全に証明し、実験計画の厳密さを向上させることができます。特に高得点記事を発表するためにもっと重要です。また、細胞モデルと動物モデルを同時に構築すると、時間を節約し、より迅速に発表することができます。

原文検索：
Zhuo M, Hui L, Wen S, et al. Deficiency of ZnT8 Promotes Adiposity and Metabolic Dysfunction by Increasing Peripheral Serotonin Production. Diabetes. 2019. DOI: 10.2337/db18-1321