Rosa26領域：遺伝子の中に安全な部位として、どんな役割分担でしょうか？

“safe harbour” （セーフ・ハーバー部位）と言及すると、まず頭の中に何を浮かぶか。今回の紹介するのは安全的に停泊できる港口ではなく、マウスの外部遺伝子が定点統合された安全部位である。さて、遺伝子の安全部位として、どんなことを示す。その中で最も典型的な安全部位の一つ：Rosa26を紹介しよう。

遺伝子ランダムの整合には何の問題があるか

細胞系と動物モデルを利用し遺伝子機能を研究する際に、一般に機能欠損或いは機能取得（gain of function/loss of function）を通じて標的遺伝子の細胞内或いは動物体内での機能と調整仕組みを研究する。機能取得は通常遺伝子ノックインを通じて遺伝子過剰発現を実現する。機能欠失は一般に遺伝子ノックアウトで達成する。本文は主に遺伝子ノックインモデルを論じる。遺伝子ノックイン（過剰発現により）とは、遺伝子組換え或いは同族組換などの方式を利用し、外来機能遺伝子或いは断片が遺伝子に挿入し、細胞で長期にわたり効果を発揮させるという技術である。

伝統遺伝子組換え技術で作製したマウスはノックインした遺伝子がランダムに整合するため、整合部位と数不確定の問題が発生する可能性がある。後代を選別しないと、タンパク発現安定なマウスを取得できないこと。遺伝子の継代後、コピー数希釈と部位ロールインは周囲の遺伝子沈黙をもらしやすいため、同種類のマウスの表現型は継代作製中で紛失しやすい。これは後期の体系設立と重複テストにいろんな不便をもたらす。

また選別不要、且つロールインした遺伝子を安定に高度発現させるため、周囲にある別の遺伝子の発現を影響しない部位は存在するか。選別を避け、遺伝子発現が安定なマウスを取得するために、外来遺伝子に安全に場所を提供する必要である。この場所に外来遺伝子は安定で高効率に発現でき、細胞と組織に副作用もないということです。

Rosa26の発見

研究者がマウス遺伝子に様々な挿入する位置を試された。特別な部位１、２つを発見された。これらの部位にDNA配列を放置しても非常に安定である。その中にRosa26部位がある。Rosa26の発見は遺伝子の史上に一番重大な発見の一つだろう。遺伝学の歴史に最も重要な突破の一つと発見された。Rosa26は、その安定した遺伝子発現特性から「セーフハーバー領域」として広く利用されています。Rosa26セーフハーバー領域の特徴や遺伝子ノックインへの応用について詳しく解説しています。

最初Rosa26はFriedrichとSorianoがマウス胚性幹細胞（ES細胞）を用いた遺伝子ターゲティング研究を行った際に発見されました。Rosa26は科学でGt(ROSA)26Sorと称され、マウス6号染色体に位置する非コード遺伝子です。ES細胞ターゲティング技術を用いることで、研究者は標的遺伝子を正確に導入したノックインモデルを作製することができます。Rosa26はその代表的な標的統合部位の一つとして広く利用されています。当該の区域は遺伝子を挿入しやすくて、機能性発現タンパクもなく、同族組替もしやすい。挿入されたタンパクが良く発現でき、他の内部遺伝子の発現と機能発揮を影響しない。全ての細胞種類と発育階段も幅広く発現している。そのため、マウスRosa26部位は遺伝子ターゲティングの安全部位と用いられる。

Rosa26部位の遺伝子ノックイン分類

一般に、以下の３種類のRosa26部位ノックインがある。

• （１）最初のバージョンである。即ち、ノックインされる遺伝子のcDNAはROSA26プロモーターで制御されて、体内に構成的に発現する（図a）。具体的に言えば、次にcDNAのスプライス受容体（splice acceptor, SA）配列の興味ある遺伝子組換えがRosa26遺伝子の第１目のイントロンのXba1制限性酵素切り部位に挿入される。組換え遺伝子の上流にネオマイシン耐性遺伝子（NeoR, 陽性選択マーカー）と３つのポリアデニル酸（pA）部位で構成した転写終結ボックス（STOP cassette）を挿入する。
• （２）コンディショナルノックインである。即ち、①で述べた変体である。転写終結ボックス（STOP cassette）の両側にあるloxP部位に別々に挿入して実現する（図b）。こんな状況で、転写終結ボックスが遺伝子組換の発現を阻止できる。Creを発現するマウスと交配し、同族組替を通じて転写終結ボックス（STOP cassette）配列を除去できる。ところが、中等の強度のRosa26プロモーターは状況によって望ましい遺伝子組換の発現レベルまで達成できないことがある。
• （３）この制限を克服するために、３つ目の提案は外来性プロモーター或いはエンハンサー（例えば、CAGプロモーター）を入れてRosa26部位の遺伝子組換え高度発現を駆動する（図ｃ）。遺伝子の体内での発現を測定するために、組換えた遺伝子の下流に両側にfrt部位があるIRES-GFPボックスをクローンする。

図. Rosa26部位の模式図：図a, 図b, 図cに示されるノックインの3つのタイプ

Rosa26部位標的方法は効率よくな正確挿入と安定なシングルコピー遺伝子が挿入発現を許可する。Cre-loxp系と結合し、遺伝子の発現時間と細胞の分類の特異性制御とを実現できる。更に重要なのは、一つの標的遺伝子ノックインとして、所要のマウス数はBAC遺伝子とPiggyBac遺伝子より組換え少ない。そのため、作業効率を上げられ、生産コストを下げられた。現時点、Rosa26で構成した遺伝子モデルは機能、機体の仕組みと薬物開発などに幅広く応用されている。

• マウスの全身発現を実現できる。Rosa26の普遍的特性を利用し、外来遺伝子を動物機体の全ての組織と細胞で発現できるようになる。例えば、あるマーカー遺伝子の発現を通じ、細胞と組織器官のマーカーを実現できる。
• 遺伝子標的の安全部位の一つとして、研究待ちのタンパクの過剰発現に用いられる。
• Rosa26領域は幅広いlacZ染色を表現する一つである。Rosa26マウスは全ての造血幹細胞と胚胎の組織でlacZを発現するようである。そのため、例えば、キメラ分析など、いろんな応用がききます。
• 配列遺伝子と毒素遺伝子をRosa26部位に挿入するという方法は特定細胞系統一に幅広く用いられた。特にCre-loxp部位特異性組替システムを利用し構成した細胞系統モデルと組換え酸素が介する遺伝子交換モデルは一番応用型である。

現在、サイヤジェンがRosa26を利用し、既にノックインモデルを1,000種類以上も作製しました。マウス以外に、他にラットと胚胎幹細胞とのRosa26部位での遺伝子標的組換えサービスも提供致します。これらのモデルは遺伝子機能、疾患の診断と治療、幹細胞と応用、RNAi等の領域に幅広く応用されています。マウス、ラットと胚胎幹細胞に標的にRosa26を組換えすることは通常の遺伝子組換えよりいろんな問題を有効に解決します。安定発現と表現型一致の外来遺伝子モデルに有効な選択肢を提供します。そのため、必ず遺伝子組換えモデルの研究と応用を促進します。

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サイヤジェン株式会社について

サイヤジェン株式会社は20年間の発展を経て、全世界の数万人の科学研究者にサービスを提供しており、製品と技術は直接にCNS (Cell、Nature、Science)の定期刊を含む16560以上の学術論文に応用されています。弊社の「ノックアウトマウスライブラリ」は低価格だけでなく、遺伝子名称を入力すれば、ワンクリックで注文まで操作できます。 ノックアウトマウス、ノックインマウス、コンディショナルノックアウトマウス、トランスジェニックマウス、GFPマウス、免疫不全マウス、無菌マウスなどのカスタマイズサービスを提供する以外、専門的な手術疾患モデルチームがあり、多種の複雑な小動物手術疾患モデルも提供できます。