ノックアウトマウスをどう同定するか？

Cyagen Technical Content Team | July 27, 2020

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二つのプライマーで遺伝子型を同定する

遺伝子工学マウス遺伝子型PCR同定の基本原則は遺伝子工学マウスと野生型マウスとのゲノムのシーケンスの違いを利用して、マウスゲノムDNAをテンプレートとしてPCRを行い、ゲル電気泳動比で異なる遺伝子型の特異産物のサイズを比較し、ストリップのサイズによってマウスの異なる遺伝子型を区別することである。今回はノックアウトマウスの同定を紹介します。

プライマーの設計

プライマーをノックアウト領域の両端に設計し、つまりF1とR1プライマーを設計する。ストリップのサイズによって遺伝子型を判断する。

予想される断片サイズ

ストリップ1のサイズ：F1/R1の拡大した野生型断片からノックアウト断片を引く。

ストリップ2のサイズ：F1/R1の拡大した野生型断片。

コメント：ゲノムを精製しないか、若しくは高忠実で高効率なポリメラーゼを使わないと、2 kbより大きいストリップは拡大しにくい。図中で2 kb以上の領域をノックアウトすると、野生型の拡大はストリップが出ない。すなわちストリップ2がない。

電気泳動の結果

電気泳動を行った後でストリップ1だけあるなら、陽性ホモマウス（-/-）と判断する；

電気泳動を行った後でストリップ2だけあるなら、野生マウス（+/+）と判断する；

コメント：ストリップ2が拡大できない場合、ストリップ1を拡大して陽性マウス（ホモ或いはヘテロ）と判定するしかない。

図1：二つのプライマーで遺伝子型を同定する

三つのプライマーで遺伝子型を同定する

プライマーの設計

使った酵素が野生型の断片を拡大できれば、上記のF1/R1というプライマーを使ってホモとヘテロを同定できる。しかし、ノックアウトする断片が大きすぎて、酵素が野生型のストリップを拡大できない場合、F/RというプライマーはF2世代のホモとヘテロを区別できない。そのため、もう一つのノックアウト区域にあるプライマーを設計して、3つのプライマーを使って短い断片システムで遺伝子型を判断できる。

図2：三つのプライマーで遺伝子型を同定する

予想される断片サイズ

ストリップ1のサイズ：F1/R1の拡大した野生型断片からノックアウト断片を引く。

ストリップ3のサイズ：F1/R2の拡大した野生型断片。

電気泳動の結果

電気泳動を行った後でストリップ1だけあるなら、陽性ホモマウス（-/-）と判断する；

電気泳動を行った後でストリップ3だけあるなら、野生マウス（+/+）と判断する。

電気泳動を行った後でストリップ1とストリップ3があるなら、陽性ヘテロマウス（+/-）と判断する。

図3：三つのプライマーで遺伝子型を同定する

コメント：上記の実験は3つのプライマーを一つのシステムにおいて拡大してもいいし、2つのシステムに分けて拡大してもいい。目的拡張断片は普通1 kb以下で、短い断片システムを使えばいい。また、もし2つのプライマーの予想断片のサイズが数十bpの差異だけあるなら、実験誤差がある場合、同一の接着剤図は2つのストリップを区別しにくいかもしれない。二つのシステムに分けて拡大するのを勧める。まず陽性であるか判断してから、ホモとヘテロを判断する。

サイヤジェン株式会社について

サイヤジェン株式会社は15年間の発展を経て、全世界の数万人の科学研究者にサービスを提供しており、製品と技術は直接にCNS (Cell、Nature、Science)の定期刊を含む5,200余りの学術論文に応用されています。弊社の「ノックアウトマウスライブラリ」は低価格だけでなく、遺伝子名称を入力すれば、ワンクリックで注文まで操作できます。ノックアウトマウス、ノックインマウス、コンディショナルノックアウトマウス、トランスジェニックマウス、GFPマウス、免疫不全マウス、無菌マウスなどのカスタマイズサービスを提供する以外、専門的な手術疾患モデルチームがあり、多種の複雑な小動物手術疾患モデルも提供できます。