ノックインマウスをどう同定するか？

Cyagen Technical Content Team | August 17, 2020

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F1世代陽性マウスのターゲットが正しいか検証する

プライマーの設計

外来DNAのシーケンスを正確に挿入するか、両側の相同腕のターゲットが正しいか検証するために、F1/R1を使用して5'arm末端を検証し、F2/R2を使用して3'arm末端を検証する。挿入区域に位置するプライマーをもう一対設計してもいい。陽性と同定されたマウスが引き続きSouthern Blot検証を行う。

予想される断片サイズ

ストリップ1のサイズ：F1/R1の拡大した5'arm末端であり、野生型の骨組み区域＋相同腕＋ノックイン区域が含まれる。

ストリップ2のサイズ：F2/R2の拡大した3'arm末端であり、野生型の骨組み区域＋相同腕＋ノックイン区域が含まれる。

コメント：ストリップ1とストリップ2は相同腕骨組み区域の検証で、サイズは通常2kb以上で拡大しにくい。サイヤジェン株式会社が納品する前に検証致しますので、再び検証される必要がありません。

電気泳動の結果

電気泳動を行った後で同時にストリップ1、ストリップ2があるなら、陽性マウスと判断する。

目的ストリップが出ないなら、陰性マウス（野生型或いは他の突然変異）と判断する。

シークエンシング

PCR同定の以外、産物のシークエンシングも必要である。F1/R1の拡大産物のシークエンシングプライマーはloxP部位に近い5’arm（図示F3）に設定する。F2/R2の拡大産物のシークエンシングプライマーはloxP部位に近い3’arm（図示R3）に設定する。

ホモ・ヘテロ遺伝子型の同定

プライマーの設計

F1世代マウスは出荷する時に既に相同腕ターゲットの正確性を検証された。1kb以下の目的断片を検証すればいい。ホモとヘテロを区別するために、ノックイン区域の上流・下流に位置するプライマーを一つ設計する。

予想される断片サイズ

ストリップ1のサイズ：F4/R4の拡大した野生型断片である。

ストリップ2のサイズ：F4/R4の拡大した挿入断片＋相同腕である。

ストリップ3のサイズ：F5/R4の拡大した一部の挿入断片＋相同腕である。

コメント：短い断片を使用するべきである。挿入する断片が大きすぎると、F4/R4が出ない可能性がある。

電気泳動の結果

電気泳動を行った後でストリップ3だけあるなら、若しくは同時にストリップ2もあるなら、陽性ホモマウス（KI/KI）と判断する。

電気泳動を行った後でストリップ1だけあるなら、野生マウス（+/+）と判断する。

電気泳動を行った後でストリップ1とストリップ3だけあるなら、若しくは同時にストリップ2もあるなら、陽性ヘテロマウス（KI/+）と判断する。

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サイヤジェン株式会社について

サイヤジェン株式会社は15年間の発展を経て、全世界の数万人の科学研究者にサービスを提供しており、製品と技術は直接にCNS (Cell、Nature、Science)の定期刊を含む5,200余りの学術論文に応用されています。弊社の「ノックアウトマウスライブラリ」は低価格だけでなく、遺伝子名称を入力すれば、ワンクリックで注文まで操作できます。ノックアウトマウス、ノックインマウス、コンディショナルノックアウトマウス、トランスジェニックマウス、GFPマウス、免疫不全マウス、無菌マウスなどのカスタマイズサービスを提供する以外、専門的な手術疾患モデルチームがあり、多種の複雑な小動物手術疾患モデルも提供できます。