パーキンソン病の研究流れ

パーキンソン病（PD）の病理学的特徴

1817年、英国の内科医師ジェームズ・パーキンソンは最初にパーキンソン病を発見し、その疾患を詳細に説明しました。その発症率は神経変性疾患で2番目にランクされています。最もよく知られている症状は、制御不能な震えである不随意振戦（Involuntary Tremors）であり、手での症状が最も明らかです。もう一つの重要な特徴はバランス能力の低下です。高齢者にとって、どんな転倒も命取りになりかねませんが、このようなバランス能力の低下は小脳損傷に関係がないことに注意する必要があります。バランス能力が低下した後、動きのバランスを保つために、患者の動作範囲と速度が必然的に低下するため、歩行や他の動きの遅さも反映されます。また、約10％の患者の中でこわばり（Stiffness）が発生しました。これは患者の書く能力に影響を与え、同じ行の字が無意識のうちに書けば書くほど小さくなることもPDの臨床参照根拠として使用できます。病気の進行の過程で、言語機能と嚥下機能も影響を受けます。

図1. パーキンソン病の主な神経機能障害

中脳黒質（Substantia nigra，SN）のドーパミンニューロン損傷は、PDの主な病理学的特徴であり、多くの死にかかっている細胞にもPDの最も重要な病理学的マーカーであるレビー小体が見られます。レビー小体はα-synuclein（α-シヌクレイン）の凝集によって形成されますが、一部のPD患者のSNでは、α-シヌクレインの存在が検出されませんでした。

黒質は、この領域にニューロメラニン色素（neuromelanin）を含有するドーパミンニューロンが凝集しているため、色が濃いことから名付けられました。この領域は大脳基底核（basal ganglia，BG）の一部に属し、大脳基底核は中脳（Middle Brain）のサブ領域です。人間の脳の観点から見ても、齧歯類の脳の観点から見ても、この領域は体積が非常に小さいですが（図3の緑色の部分は中脳全体を表し、黒質は矢印で示された点線の近くの部分のみであることに注意してください）、動物の運動にとって非常に重要です。ドーパミンの機能はもちろん、SNは小さいですが、黒質緻密部（Substantia nigra pars compacta，SNc）と黒質網様部（Substantia nigra pars reticulata，SNr）の2つの領域に分けることができ、そのうち、緻密部には多数のドーパミンニューロンが含まれており、PDの最も打撃を受けた領域でもあります。SNr領域は、BGおよび他の脳領域からの入力信号を受信して処理します。SNcでのドーパミンニューロンは、SNrによって提供された情報に従って線条体（striatum）にドーパミンを提供し、それによって運動を調節します。PDは、上記のこの領域のドーパミンニューロンの死によって引き起こされるドーパ​​ミンの分泌不足により、視床が制御に関与する過程において障害が生じます。

図2. PDの主な病変の位置および病理学的特徴

パーキンソン病の薬物/治療法の開発

パーキンソン医師はPDを発見した時にも症状だけを発見しました。その後の研究では、解剖によって脳の黒質の病変がPDの発症につながる原因であることがわかりました。20世紀に入った後、病原性蛋白質の凝集によって形成されたレビー小体が発見されました。第二次世界大戦後の科学技術の発展は、ドーパミンの発見のために基礎を築きました。そのため、ドーパミン類似体がPD治療に使用され始めました。ドーパミン機能を強化することを主な目的としているこれらの薬は成功も失敗もあります。病気の体を元に戻すことは不可能ですが、それらの研究により、重要な神経伝達物質であるドーパミンについての理解が大幅に深まりました。

もちろん、これらの薬の一般的な欠点は、一定期間使用すると効果が大幅に低下し、明らかな副作用があるものが多いことです。したがって、人々はレビュー小体とレビー小体を構成するα-シヌクレイン（α-synuclein）に対してさまざまな治療スキームを開発しました。主要なアイデアが３つあります：1.免疫療法でシナプスとタンパク質の拡散をブロックします; 2.シヌクレインの凝集を阻害します; 3.シヌクレインの分解とクリアランスを増加させます。しかし、現在、効果的な薬を製造する方法はありません。さらに、脳内のさまざまなシグナル経路が密接に関連しているため、ミトコンドリア、小胞体、オートファジーやカルシウムイオンシグナルを対象とするさまざまな医薬品開発スキームが実施されています。

遺伝子治療は主に不活化ウイルスベクターを通じて神経栄養因子または他の重要なタンパク質遺伝子をパッケージングし、対応するタンパク質を発現してドーパミン合成の回復を促進し、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNFとNeurturin）などのドーパミンの代謝を調節しますが、動物実験での良い効果は、臨床試験ではうまく再現できません。しかし、次々と試みられている様々なスキームの遺伝子治療法がまだあります。

要するに、現在、FDAによって承認されたPD薬のほとんどは、ドーパミン機能の調節に焦点を合わせています。実際、パーキンソン病はほとんどの場合にパーキンソン症候群であるはずなので、運動を中心とした症状に加えて、パーキンソン病によって引き起こされる他の神経学的問題も無視できません。

PDの治療には、特別な脳深部刺激（Deep Brain Stimulation, DBS）療法があります。この方法では、脳に電極を挿入して対応する脳領域の活動を刺激し、症状を緩和する効果を実現しますが、しかし、このような方法は特定のPD患者にのみ有効であり、やむを得ない場合を除き、一般の人々には優先的に薬物治療を選択します。しかし、技術の進歩に伴い、このような治療スキームは効果が徐々に改善され、損傷の度合いが徐々に低下するため、徐々に患者さんに受け入れられています。しかし、そのコストは比較的高く、効果は症状の改善に限られており、治療効果も病気が進行するにつれて徐々に失われていくため、病気の原因に基づいて薬や治療法を開発することは依然としてPD治療の一番重要な課題です。

図3. PD治療法の発展過程

パーキンソン病（PD）モデルの構築と選択

PD遺伝子関連モデル

PDのメカニズムを研究するためには、PDの動物モデルが不可欠です。ここではまず、遺伝子編集法で作ったPDモデルを紹介します。α-シヌクレインは最も直接的なPD疾患タンパク質であるため、そのトランスジェニックマウスの開発も最も早く、対応する遺伝子がSNCAと呼ばれ、Park1とも呼ばれています。家族性PDの3つのPark1突然変異（A30P、A53T、およびE46K）と、この遺伝子のコピー数の異常増加はいずれもPDの発症の主な原因です。上記のPDの病因に基づいて作られたトランスジェニックマウスは実験で広く使用されています。ヒト突然変異α-synucleinを発現する一部のマウスは、線条体でのドーパミンが有意に減少し、一部のグループは、レビー小体前駆体と同様の封入体が現れ、PD症状も現れました。しかし、残念ながら、α-シヌクレインを対象とするほとんどすべての遺伝子編集マウスは有意な黒質ニューロン死が発生しませんでした。

LRRK2はオートファジーに関連する遺伝子であり、遅発性PDに関連していますが、現在、この遺伝子を単独で操作する遺伝子編集動物でPD表現型を取得することは困難です。過剰発現、ノックアウト、ノックインのいずれであっても、ラットとマウスは同じようにあまり効果がありません。LRRK2ノックアウトマウスはレビー小体を生成しませんが、ある程度α-synucleinの凝集を引き起こし、一部のグループはまた、ジスキネジアが生じる可能性があります。

PINK1は別の遅発性PDに関連する遺伝子ですが、cKOマウスのSNcでシヌクレインが過剰発現すると、その領域の多数のドーパミンニューロンが死滅します。一方、PINK1遺伝子を直接ノックアウトすると、線条体のドーパミンが減少しますが、ドーパミンニューロンの死を引き起こしません。E3リガーゼPARKINがマウスでノックアウトされた後、一部のマウスでドーパミン発現がわずかに低下したことを除き、変化はありませんでした。

DJ-1は早期発症型PDに関連していますが、ほとんどの改変マウスはヒトのPD表現型を再現できません。しかし、C57を背景とするcKOマウスでは、研究者が、早期発症型のSNc領域ドーパミンニューロンの有意な喪失を発見しました。このような変化は加齢とともに激しくなり、軽い運動障害が発生します。マウスの表現型を繰り返すことができれば、このグループは、PD研究で宣伝する価値のあるモデルでもあります。ATP13A2はリソソーム関連のATP酵素であり、現在、この遺伝子に関する研究は少ないですが、PD研究が期待されています。

図4. PDモデル関連遺伝子

1990年から2018年までのPD研究を統計したところ、現在、ラットとマウスは発表された論文数の85％を占めていることがわかりました。マウスは、その初期の遺伝子編集が比較的簡単なために、急速な進歩を遂げています。しかし近年、遺伝子編集技術CRISPR/Cas9技術の広範な応用と成熟に伴い、PDの遺伝子編集のラットモデルも大きな発展を遂げています。

PDの遺伝子編集モデルは一般的に特に明白な表現型を持っていませんが、それを私たちの研究分野で関連する遺伝子突然変異または機能異常モデルとハイブリダイズさせることができます。これらの新しい遺伝子の追加は、PDのさまざまな表現型にも影響を与えるため、私たちのPD機能と治療に関する研究に役立ちます。サイヤジェンは、新しいモデルの開発を支援することにも取り組んでいます。

家族性パーキンソン病に関連する遺伝子は数多くあり、サイヤジェンはこれらの重要な継承性遺伝子に関連する一連の疾患モデルを開発しており、PD動物モデルの半数以上が生きた状態でサイヤジェンレッドラットリソースバンクに保存され、さらに、サイヤジェンの研究開発チームは、新しい遺伝子編集動物の研究開発にも取り組んでいます。

図5. PDモデル関連の表現型

手術/薬物処理モデル

上記のように、化学的誘導は、PDモデリングにおいて重要な位置を占めており、それは、短期間に深刻なPD表現型を誘発することができるためです。しかし、化学的に誘発されたPDモデルの不足も明らかです。つまり、ドーパミンニューロン死の速度が速すぎます。正常な人間では、ドーパミンニューロンの死亡プロセスからPDの発症まで通常10年以上かかりますが、化学的に誘発されたニューロンの死は、人間の数十年にわたって死んだニューロンの数に達しました。そして、最も深刻なニューロンとドーパミンの喪失を伴うこれらのモデルでは、レビー小体が現れませんでした。

MPTPは、PDモデルを確立するために使用された最初の化学毒性物質です。興味深いのは、MPTPは非ヒト霊長類（NHP）とマウスには強い毒性がありますが、ラットに対する毒性がそれほど強くありません。NHPまたはマウスの実験のいずれかにおいても、MPTPは深刻な黒質ニューロンの喪失と線条体ドーパミンの減少を引き起こす可能性があります。上記の損傷は、PDのこの部分の病理学的表現型に対する非常に優れたシミュレーションですが、この物質はレビー小体を誘発することができません。

MPTPと比較して、6-OHDAはラットPDモデルの構築に使用できます。ただし、6-OHDAは血液脳関門を通過できないため、ほとんどの場合、脳に直接注射されます。この薬は注射後2、3日以内に多数のニューロンの死を引き起こし、それによってNAc領域のドーパミンが90％以上減少します。MPTPと同様に、この薬はドーパミンニューロンに特効があり、他の種類のニューロンは損傷が軽いですが、6-OHDAがレビー小体の生成を誘発しません。

長期的にrotenone（ロテノン）を使用すると、ラットの黒質線条体のドーパミンを減らすことができ、また、人間のPDと同様の多くの症状を引き起こす可能性があります。さらに重要なことは、rotenoneはまた、レビー小体になる可能性のある最初のα-シヌクレインポリマーを生成するようにニューロンを誘導することもできることです。

Paraquat（パラコート）は、PDの運動症状の一部を誘発できるだけでなく、黒質ドーパミンニューロンおよび線条体ドーパミンに対しても有意な抑制効果を示し、レビー小体の生成を誘発することもできます。

さらに、METH（methamphetamine）とMDMA（methylenedioxymethamphetamine）もPD化学モデリングによく使用される物質です。

図6. 化学的に誘発されたPDマウスモデル

行为学实验

運動能力に使用されるテストは、一般的にPDのテストに使用できます。図8では、主流となっている運動テスト方法を示しています。

（1）円筒形のバレルテスト (Cylindrical Barrel Test)： まずは円筒形のバレルテストです。このテストでは、マウスが透明な円筒に入れられます。動物は前足でバレルの壁に触れて探索します。触れたときの姿勢、前肢の好み、および立っている時間の長さが動物の運動およびバランス能力を特徴づけます。

（2）随意運動ローラー (Autonomous Motion Roller)：次は、飼育ケージや特別な実験施設に設置できる随意運動ローラーであり、動物の自発的な動きの初期状態や全過程をテストし、ローラーの回転速度で動物の運動スキルを研究することができます。

回転流量計は通常、精神刺激薬または運動刺激薬を使用した後、動物の回転バイアスを測定することにより、側性病変の程度とその後の介入治療の有効性を評価するものです。

転がり装置の回転ロッドは、固定速度または加速速度で回転できるビームです。マウスは中央の回転ロッドに置かれ、落下の潜伏期間はそれらの運動協調性を測定するために使用できます。

（3）平均台試験 (Balance Beam Test)：平均台試験では、マウスがビームに置かれ、平均台上を移動する能力がバランス能力を反映すると考えられています。マウスの足のサイドスリップの回数と時間は、その足の力と運動協調性を特徴づけるために使用できます。

歩行分析装置を使用するか、マウスの足にインクまたはペンキをつけ、廊下をターゲットボックスまで走るときに足跡を残すようにします。歩幅、基部幅、および前肢と後足が重なる測定は、歩調の指示を提供します。

これらの実験では、転がり装置は間違いなくPD研究で最も広く使用されており、より簡単であり、AD研究における水迷路の適用に相当します。

図7. PD関連の行動学研究方法

パーキンソン病の病理学的テスト

パーキンソン病の主な病巣は、中脳黒質緻密部でのドーパミンニューロンの死であり、これにより、この領域でのドーパミン分泌が不十分になり、下流の線条体の正常な機能に影響を及ぼします。したがって、PDの画像研究は主に中脳黒質と線条体に集中しています。ドーパミンの発現と分泌のレベル、およびこれら2つの脳領域間の投射関係がスムーズであるかどうかは、PD病理学的重要な指標になっています。マウスおよびラットとヒトの間の遺伝的類似性は90％以上に達しています。経済的要素および実験的サイクルを考慮すると、現在、二者は依然としてPD研究モデルの主力であり、この二種類の動物の脳領域投射関係が人間と非常に似ています。

図8. PDの主な病理学的特徴

PD患者の脳の解剖により、中脳黒質緻密部の黒いニューロンが減少し、これらのドーパミンニューロンの死滅に伴い、グリア細胞が元のニューロンの代わりに大量に増殖したことがはっきりと分かりました。PD患者のこのエリアのドーパミンニューロンは、同じ年齢の対照よりも30％〜60％少なくなっています。細胞内に目を移すと、レビー小体がPDの最も重要な特徴になります。図10A-Cの黒質緻密部では、細胞が黒いレビー小体で満たされているのがわかりました。図10Dの前頭葉にもレビー小体が現れていますが、黒質緻密部ほど深刻ではなく、細胞内のレビー小体もより小さく、穴があります。ただし、マウスモデルでレビー小体をシミュレートすることは非常に困難です。したがって、現在の動物実験では、通常、α-シヌクレインの凝集が検出されている限り、この動物はPDの疾患モデルと見なすことができます。

図9. PDの主な病理学的特徴

パーキンソン病のシグナル経路研究

PDシグナル経路にはミトコンドリアの完全性の破壊とタンパク質のヘテロロケーションが存在します。後者は、ユビキチン-プロテアソーム系（UPS）の機能とオートファジーを介した分解経路の変化によって異常です。

遺伝的原因によると、酸化還元ストレス、エネルギー不足、タンパク質凝集、およびミトコンドリアDNAによって誘発された炎症などの要素の組み合わせにより、細胞代謝産物の段階的な蓄積が引き起こされ、最終的には細胞死につながり、損傷したドーパミンシステム経路と一部の感覚ニューロン（例えば嗅覚）の喪失として示されます。

α-シヌクレインの突然変異またはSNCAの過剰発現は、小胞の凝集と融合を妨げ、それによって小胞体（ER）からゴルジ装置への輸送経路を破壊する可能性があります。似ている突然変異はまた、シナプス小胞の放出を妨げる可能性があります。SNCAは構造が折りたたまれていないタンパク質であり、その突然変異体が凝集しやすいです。それは他のタンパク質をポリマーに動員し、ポリマーとユビキチン化された積み荷タンパク質をカバーする可能性があり、これらはすべてParkinを含む機能E3ユビキチンリガーゼを必要とします。

Parkin、UCHL1およびSNCAの突然変異はすべて、ユビキチン-プロテアソーム系（UPS）を妨害し、ストレス反応を引き起こし、ニューロンのアポトーシスを引き起こす可能性があります。一般的には、プロテアソーム機能不全は通常、他の細胞救済メカニズムを引き起こす可能性があります。たとえば、シャペロンを介したオートファジー（CMA）をアクティブにし、LAMP2a受容体を介して異常なタンパク質をリソソームに移動します。ただし、突然変異したSNCAまたは機能獲得型突然変異が発生したLRRK2などの蛋白質は、CMA機能不全につながり、それによってこの救済プロセスを完了できない可能性があります。

特定の突然変異したLRRK2はまた、ミトコンドリアの病理学的変化を引き起こし、ミトコンドリアが分解される度合いの向上を引き起こす可能性があります。このプロセスは、ミトコンドリアの生存を維持する重要なタンパク質をユビキチン化します。この過程で、Pink1はParkinと結合し、Parkinは損傷したミトコンドリア断片の外膜タンパク質のユビキチン化プロセスにさらに関与します。これらの重要な膜タンパク質のユビキチン化は、最終的にミトコンドリアの分解を促進します。さらに、LRRK2はミトコンドリアの分裂/融合の調節因子でもあります。

過剰な分裂とミトコンドリア機能障害はすべて、ROSの増加に関連しています。DJ-1は、ミトコンドリアにおいて酸化還元センサーおよび抗酸化剤として機能し、ミトコンドリアのエネルギーバランスとレドックスホメオスタシスの維持を支援します。散発性パーキンソン病に関連する他の突然変異には、多くのリソソーム関連酵素、グルコセラミダーゼ（GBA1）-ガラクトシダーゼA（GLA）、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ1(SMPD1およびNiemann Pick disease type 1 (NPC1)が含まれています。それらはリソソーム関連疾患にも関連しています。下図に示されているPD関連遺伝子のうち、白色背景が劣性、赤色背景が優性、灰色背景がPDリスク遺伝子です。

上記の経路の変化は、PD研究における重要な表現型のテスト項目であり、実験の因果関係を検証するためによく使用されています。

図10. PDシグナル経路

パーキンソン病の研究事例分析

図11. パーキンソン病の研究事例

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